多项实验操作技术.docVIP

实验用方法步骤 Sup 1.1 PCR （使用Transgene PCR Taq Mix，货号：20915） 在PCR反应管中调制反应液： Reagent Quantity, for 25μl of reaction mixture Taq DNA Polymerase Mix 12.5 μl 10μM Primer 上游 1 μl 10μM Primer下游 1 μl cDNA 1 μl Sterile deionized water Up to 25μl Total 25 μl /Sample 反应根据实际情况 将各加入到0.ml的PCR薄壁管中； PCR扩增： Step Temperature, °C Time, min Number of cycles Note 起始变性 95 3 1 变性 94 0.5 30-35 退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化 退火 60-70 0.5 延伸 72 0.5-1.5 每分钟延伸1000bp 最终延伸 72 10 1 反应结束后，取扩增样品5μl，琼脂糖凝胶电泳分析结果，DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备分析使用。 Sup 1.2 琼脂糖核酸电泳 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放制胶板上，架好梳子； 根据DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的凝胶：称量琼脂糖干粉，加入三角烧瓶内，加入TAE电泳缓冲液（20~30 ml）； 微波炉内加热熔化冷却片刻，加入荧光染料(EB)，充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固； 室温下凝胶完全凝结，拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内； 倒入电泳缓冲液量以没过胶面1mm为宜除去样品孔内气泡； DNA样品中加入10×Loading buffer，混匀，将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内； 接通电源，红色为正极，黑色为负极，使DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。电压60～100V，电泳20～40min； 根据指示剂泳动的位置，终止电泳； 在凝胶成像仪上观察电泳带及位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800～12,000 1.0% 500～10,000 1.2% 400～7,000 1.5% 200～3,000 2.0% 50～2,000 Sup 1.3 胶回收纯化DNA 琼脂糖电泳，将用刀切下放入到EP管中，称重量； 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，57振荡器中温育振荡，直至溶解； 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2，8,000rpm 离心1，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中； 加700μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心30，弃收集管中的液体； 加500μl的wash buffer重复洗涤一次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30，除去残留的wash buffer； 将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者lution buffer至纯化柱膜的中央，室温放置2，10,000rpm离心1洗脱DNA，将DNA溶液放-20℃保存备用。 Sup 1.4 酶 切（应用NEB限制性内切酶，双酶切） 确定待切样品的浓度选择合适的限制性内切酶和Buffer。 在管中加入如下成分： Reagent Quantity, for 40μl of reaction mixture 10×Reaction Buffer 4 μl 限制性内切酶1 2 μl 限制性内切酶2 2 μl 待切样品 xμl Sterile deionized water Up to 40μl Total 40 μl /Sample 混匀样品，离心使样品沉于管底。 将离心管置于37中温育1-3。 用未酶切的质粒或DNA片段作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。 Sup 1.5 连 接（应用NEB T4 DNA连接酶） 确定待经酶切回收后的载体片段的浓度。 在管中加入如下成分： Reagent Quantity, for 40μl of reaction mixture 10×Reaction Buffer 4 μl T4 DNA连接酶 2 μl 待连接样品 载体与片段的mol比为1∶4 Sterile deionized water Up to 40μl Total 40 μl /Sample 混匀样品，短暂离心使样品沉于管底。 16连接过夜，连接完的样品直接用于转化或-20冰箱