Sonic+Hedgehog信号通路和肾间质纤维化关系研析.pdf

·中文论著摘要· Soni chedgehog信号通路与肾间质纤维化关系的 研究 刖 舌 interstital 肾小管间质纤维化(renal kidney renal 此，改善RIF对减缓和逆转CKD的进程具有重要意义。 RIF的发生和发展过程主要有以下4个环节：①细胞因子的表达调控；②炎性 维细胞等细胞转变为肌成纤维细胞的过程。ECM在肾间质的过度沉积亦是引起 RIF的主要原因，成纤维细胞作为肾间质内主要固有细胞之一，是RIF过程中最主 要的ECM分泌细胞。研究表明在RIF过程中，成纤维细胞的特性可发生改变，如 发生表型转变，转分化为肌成纤维细胞，表达Q．SMA，细胞表现为增生和分泌能力 增强、生成大量ECM。ECM在肾间质中产生增多和分解减少造成ECM大量沉积， 从而导致RIF，但其具体调节机制尚不清楚。 脊椎动物Hedgehog(Hh)家族可分为3个亚群：Desert Hedgehog(IHh)；Sonic 路的转录调节因子包括Glil一33个异构体，Glil即是Hh信号通路的转录调节因子， 又是目的基因，Glil的表达增加是Sm信号通路激活的可靠指标。近年研究发现 在肝脏、肺脏等多种脏器纤维化过程中SHh信号通路发挥重要作用，且可能同SHh 信号通路上调Snaill的表达，促进EMT有关。关于S埘l信号通路与慢性肾脏病 的关系则未见报道。 除阻断SHh通路，观察能否减轻RIF，体外培养大鼠肾成纤维细胞株NRK．49F， 予SHh蛋白激活SHh通路，观察NRK．49F细胞表型活化及细胞外基质表达情况， 同时观察给予CPN阻断Sm通路对其影响，为防治RIF提供重要的理论依据和 方法。 材料与方法 l、手术单侧结扎输尿管梗阻性肾病(UUO)动物模型的建立 2、UUO小鼠0、3、7、14天肾组织RT-PCR、westernblot等方法检测SHh、 Glil表达 3、应用免疫组化及化学方法检测Glil蛋白在UUO小鼠纤维化肾脏中的表达 部位和表达水平的变化 4、应用UUO7天后的小鼠肾组织，实时PCR、间接免疫荧光、Masson’s 基因敲除鼠与野生型鼠相比，或给予CPN腹腔注射阻断SHh通路的小鼠与给予安 慰剂的小鼠相比，肾间质纤维化能否减轻及EMT主要调节因子Snaill的变化情况。 5、体外培养大鼠成纤维细胞株NRK一49F，予人SHh蛋白刺激(不同时间点、 blot等方法检测a．SMA、 50ng／m1)，48h后应用实时PCR、间接免疫荧光、Western 肌丝蛋白、纤维连接蛋白、I型胶原、Snaill的表达，观察激活SHh通路能否促进 大鼠肾成纤维细胞表型活化、细胞外基质表达增加，CPN阻断SHh通路对其影响， 及SnaillmRNA的变化，每组设3个复孔。 6、统计学分析：实验数据用跫s表示，使用SigmaStat统计软件进行统计 分析，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P0．05表 示差异有统计学意义。 2 结 果 订ichrome染色显示胶原沉积减轻，无论实时PCR还是间接免疫荧光结果均表明， 的表达减低。 3、与单纯UUO小鼠相比，应用SHh通路阻滞剂CPN腹腔注射的UUO小鼠， 肾间质Masson’s 胶原、纤维连接蛋白表达下降，同时SnaillmRNA的表达也减低。 4、体外培养大鼠‘肾成纤维细胞株NRK．49F，予人SHh蛋白刺激，可见 GlilmRNA的表达呈时间及浓度依赖性增加，同时肌成纤维细胞的标志蛋白 0【．SMA、肌丝蛋白表达增加，细胞外基质如纤维连接蛋白、I型胶原等表达上调， 依赖性下调。 F匕： 当日结 论 l、肾间质纤维化时SHh信号通路激活，Glil在肾间质细胞细