细胞生物学新技术.pptVIP

CAX 小鼠基因型的检测策略 Southern blot +/+ -/- +/- 22.86 kb 22.86/9.9 kb 9.9 kb Bh 2.1Kb 2.5Kb probe Bh Bh 8.1kb 1.8kb 22.86 kb 6.4kb a b c d 同源重组阳性的ES细胞鉴定结果 ES细胞阳性克隆 51 95 M CAX 的嵌合体小鼠 CAX 小鼠基因型的检测策略 PCR +/+ -/- +/- 2.8 kb 1.5/2.8 kb 1.5 kb Bh 2.1Kb 2.5Kb probe Bh Bh 8.1kb 1.8kb 22.86 kb 6.4kb a b c d CAX小鼠后代的基因型检测结果 F1代鉴定结果 F3代鉴定结果 a/b primer a/b primer c/d primer Inactivation of CAX through Homologous Recombination G3PDH mCAX M +/+ +/+ +/- +/- -/- -/- 胚胎成纤维细胞的制备 ①取12～14d的妊娠小鼠，颈椎法处死后，用75％酒精浸泡5min。 ②无菌条件下剖腹，暴露子宫，取出胎鼠，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤以去除血迹。 ③去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，PBS液洗净，用灭菌的眼科小剪刀把组织块剪至1mm3大小,向组织块加入适量的胰蛋白酶－EDTA消化液，37℃下消化2０min。 ④加等体积含血清的培养基终止消化，静置，将组织块沉降后，将培养基吸至无菌试管中。 ⑤无菌试管离心（1 000r/min）5min，弃上清，沉渣用含10%小牛血清的低糖DMEM培养液悬浮后接种至25cm2一次性培养瓶，置于37℃、5％CO2、100%湿度的培养箱中培养。 ＣＡＸ剔除小鼠的杂合子后代符合孟德尔的 遗传规律 ＣＡＸ -/-小鼠的胚胎发育正常 对出生后小鼠的观察表明，ＣＡＸ -/-小鼠的形态、生长、繁殖无明显异常 研究蛋白质在细胞内的活动情况需要从哪些方面入手？ 通常有哪些实验手段可以用来研究蛋白和蛋白的相互作用？ 通常有哪些实验手段可以用来研究蛋白和DNA的相互作用？ 何为报告基因? 其有哪些研究用途？ 可用哪些技术对细胞内某个蛋白的水平进行干预? 它们有什么区别? 负显性突变：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变，所得突变体不仅丧失了原有功能，并且可以抑制内源性蛋白质的功能。 DNA microarray：是一种用于分子生物学和医学领域的高通量技术. 它由一系列成千上万个精微的DNA寡核苷酸点排列而成，这些DNA寡核苷酸含有百亿分之一摩尔特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是DNA的其他成分。它们被作为探针，在非常严格的条件下和一个叫做靶分子的cDNA 或 cRNA样本杂交。由于靶分子带有荧光标记，因此通过探针-靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无 ，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。 共激活因子：是一种蛋白，本身不能与DNA结合，但能够通过与具有DNA结合结构域的激活因子（或转录因子）结合来增强基因的表达。共激活因子可调节转录的许多其他过程，如转录的延长、终止、 RNA剪接以及激活因子和共激活因子复合体的降解等。 报告基因: 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。 染色质免疫沉淀技术: 研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）:是一种研究核酸结合蛋白和其相关的核酸结合序列相互作用的技术。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-蛋白复合物或RNA-蛋白复合物比非结合的探针移动得慢。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或单链。检测可用纯化蛋白、部分纯化蛋白或核细胞抽提液。 本文档支持任意编辑，下载使用，定会成功！ * * * * * * An electrophoretic mobility shift assay (