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分子生物学(10个主干实验)步骤
《生物学实验四》实验操作步骤
2010年3月
实验一、细菌培养、细胞培养
实验二、昆虫病毒DNA的分离、纯化和鉴定
1、2 ml病毒感染的培养细胞悬浊液
↓8000 r/min 4℃ 10min，去上清
2、 加PBS漂洗混匀
↓ 8000 r/min 4℃ 10min ，去上清
3、加250μl TE 悬浊
↓
4、加250μl Lysis Buffer裂解细胞
↓
5、 加20μl Proteinase K（10mg/ml ）
↓50℃ 4h /37 ℃ 过夜
6、加3μl RNase A（10mg/ml ）
↓37℃ 30 min
7、 加等体积酚-氯仿
↓12000 r/min 4℃/10min
取水相（剪枪头，烤平）
8、重复步骤7
9、水相加1/10体积 3mol/L NaAC（pH4.8）
↓
10、加2倍体积的无水乙醇沉淀病毒DNA
↓-20℃，过夜
↓12000 r/min 4℃/5min，去上清
11、70% 乙醇洗涤沉淀
↓12000 r/min 4℃/5min
去上清
12、重复步骤11
13、适量TE 溶解
↓
14、电泳鉴定
实验三、PCR扩增昆虫杆状病毒基因及其产物的鉴定PCR反应体系
TaqDNA 聚合酶 0.5μl
10×PCR Buffer 5μl
dNTP 4μl
Template(病毒基因组DNA) 1μl Primer1 1μl
Primer2 1μl
ddH2O 37.5μl
——————————————————
Total 50 μl
2、PCR反应程序：
94 ℃ 3min
94 ℃ 30s
55 ℃ 30s 3 cycles
72 ℃ 1min
72 ℃ 10min
4 ℃ forever
实验四、质粒DNA的分离、纯化和鉴定LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜
↓
2.取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，4℃ 3000r/min 离心5min
↓
3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥
↓
4.碱法少量快速抽提质粒DNA（详见4）
↓
5. 质粒DNA的鉴定DNA
单菌落 Sup
↓接种 ↓
3ml LB培养基（含Amp或Kan 100ug/ml） add 等体积酚：氯仿（1：1）
↓ ↓混匀
37℃ 200rpm振荡过夜培养 4℃、 12000rpm、 10min ↓
↓ Sup
↓
取1.5ml培养物于Eppendorf管内 add 2×Vol无水EtOH
↓ ↓混匀
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