T-SPOTTB实验技术解析.ppt

* * 结核感染时，有活性的效应T淋巴细胞主要集中在炎症反应的部位以对抗感染，如胸腔积液、支气管肺泡灌洗液、腹水、脑脊液、肠道灌洗液，血液中的效应T淋巴细胞只占所有效应T淋巴细胞的20%-30%，因此，检测炎症部位体液的效应T淋巴细胞有利于区别结核感染和其他原因导致的炎症反应，对确诊结核病具有重要的临床意义。 非血样本的检测辅助判断活动性结核——对临床判断活动性结核或其它病症有非常大的帮助，是T-SPOT检测的独占优势。 非血标本的检测意义 * 胸水 腹水 心包积液 关节液 脑脊液 支气管肺泡灌洗液（BAL）？ 非血标本的种类 * 胸水、腹水、心包积液：无菌密闭容器留取50ml以上，每100毫升加2500IU肝素（0.4ml）抗凝并立即混匀； 关节液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀； 脑脊液：无菌小瓶留取4ml以上，每毫升加125IU肝素（0.02ml）抗凝并立即混匀 。 采集量及抗凝剂的添加量 注：抗凝剂肝素可以是“肝素钠注射液”2ml：1.25万单位 非血标本的采集 * 采集容器选择 胸水、腹水、心包积液等因所需的体积比较大，推荐用盐水瓶（氯化钠注射液）留取，具体方法：新打开一瓶盐水，倒掉里面的液体并将抽取的胸水、腹水或心包积液等打到里面，按上述比例添加抗凝剂并立即混匀。 注意：可以选择直接将标本打到肝素采血管内，但不能用饮料瓶、塑料酒精瓶等留取标本。 脑脊液和关节液因所能得到的体积比较小，可以用无菌带盖采集管留取。 非血标本的采集 * 容器推荐 非血标本的采集 * 该混悬液示为血液轻轻加到4ml Ficoll液面上 斑点计数 取20~30ml标本于2个15ml离心管内 倒掉上清掉，再加入1640至10ml重悬沉淀 倒掉上清掉，在2支管子中共加入1640 8ml左右混匀并合并于一管中 600g，7min 600g，7min 吸出细胞，加1640至10ml洗涤 倒掉上清，加1640至10ml洗涤 1000g，22min 600g，7min 倒掉上清，加500 μl AIM-V重悬 350g，7min 台盼蓝5倍稀释用显微镜计数细胞 洗板加酶标二抗 洗板显色 2.5 ×106/ml 加板 37 ℃， 5%CO2，16~20h 2~8 ℃，1h 室温，7min 注意：最开始洗涤时如果发现离心后的沉淀很少，应增大标本量，再取20~30ml，将沉淀合在一起；非血标本中会出现一些类似于大细胞的杂细胞，细胞计数时注意不要数上，但如果杂细胞太多要考虑适当的加大稀释。 检测步骤——胸水、腹水、心包积液和关节液 * 将脑脊液转入15ml无菌离心管中/如果是离心管直接采集的可直接离心即可 倒掉上清，加入5~10ml AIM-V混匀 倒掉上清，加加500 μl AIM-V重悬 700g，7min 台盼蓝5倍稀释用显微镜计数细胞 洗板加酶标二抗 洗板显色 2.5 ×106/ml 加板 37 ℃， 5%CO2，16~20h 2~8 ℃，1h 室温，7min 注意：脑脊液细胞往往不多，谨慎加样。 600g，7min 斑点计数 检测步骤——脑脊液 * 添加的肝素量不一定非常准确，但一定要加； 凝块会严重影响淋巴细胞的数量，如果发现有凝块不建议继续操作； 样本采集后4小时内必须送至实验室，常温保存（15-25℃），不可冷冻或冷藏； 脑脊液的细胞往往比较少，为提高实验效率或成功率，操作之前可以先查一下“常规”数据中有无淋巴细胞； 非血标本T-SPOT检测时，需同时送检病人血样； 非血标本单个核细胞的计数采用显微镜下计数； 不可使用配有海绵（半固体组织）或垫片的淋巴细胞分离管。 操作注意事项 * 血样结果 非血结果 可能解释 + + 活动性TB - - 非TB + - 潜伏感染（LTBI）/病灶部位非TB - + 活动性TB（提高检出率） 临界值 灵敏度 特异性 6 86-100% 60-80% 14 92% 89% 25 80% 65% （文献数据，仅供参考） 结果分析及讨论 * 文献：Utility of T-Cell Interferon-c Release Assays for Diagnosing Tuberculous Serositis: A Prospective Study in Beijing, China PLOS ONE 2014 目的：评估通过T-SPOT方法检测浆膜腔积液中的T淋巴细胞，对于结核性浆膜炎的诊断效率。 方法：选取了北京协和医院2008年至2011年收住的，以包括胸腔积液、腹腔积液、心包积液等在内的浆膜腔积液为主要临床表现的、疑诊为结核性浆膜炎的20