高效阴离子交换分离脉冲安培检测茶叶多糖中的半乳糖葡萄糖甘露糖和果糖.docVIP

高效阴离子交换分离-脉冲安培检测茶叶多糖中的半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖 摘要：建立了高效阴离子交换分离-脉冲安培检测（HPAE-PAD）同时分离测定茶叶多糖中的半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖的分析方法。以METROSEP CARB 1（150×4.0mm）阴离子交换柱为分离柱，以6.0mmol/L NaOH溶液将4种单糖从分离柱上洗脱，淋洗液流速为1.0 mL/min，总分析时间为45min。用所建立的方法快速、有效分析了4种茶叶多糖，并得到了满意的检测结果。 关键词：离子交换分离，脉冲安培检测，茶叶多糖 茶多糖（Tea polysaccharides，简称TPS）是茶叶中具有特殊生物活性的一类与蛋白质结 合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白。药理研究表明，茶多糖具有显著的降血糖效果和免疫活 性，使茶多糖有望成为预防与治疗糖尿病和心血管疾病、提高免疫功能的天然药物。近年来， 大多数研究表明茶叶中茶多糖的重要功能，但在茶多糖的检测方面，高效、便捷、快速的方 法还很欠缺。中国色谱网 离子色谱法测定糖类逐渐被学者们所关注，鉴于糖类化合物分子具有电化学活性和在强 碱溶液中呈离子化状态，Roxklin等于1983年首先报道了用阴离子交换色谱柱分离，脉冲安培检测器测定糖的新方法。本文运用温水浸提，乙醇沉淀，超声辅助乙酸水解法，方便、高效的提取了茶叶中的多糖，并以NaOH溶液作为流动相，研究了用离子交换色谱分离-脉冲安培检测半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖的方法。 1 实验部分： 1.1 仪器和试剂 仪器：瑞士万通公司（Metrohm）861 Advanced Compact IC，817 Bioscan脉冲安培检测器，833 IC Liquid Handing Unit蠕动泵，METROSEP CARB 1（150×4.0mm）阴离子交换柱，色谱工作站为Metrohm IC-Net 2.3。 试剂：半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖标样购于Sigma公司，绿茶（西南农业大学特级绿茶），普洱茶（云南省西双版纳隆昌茶叶有限公司出品一级普洱茶），乌龙茶（特级铁观音,半发酵乌龙茶福建省安溪裕安茶厂），红茶（安徽省芜湖市清福茶叶有限公司一级红茶）。 1.2 色谱条件 分离柱：METROSEP CARB 1（150×4.0 mm）阴离子交换柱，淋洗液：6 mmol/L NaOH溶液，流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL，柱温：32℃，再生液：200 mmol/L NaOH。 1.3 标准溶液和样品溶液的配制 （1）标准溶液的配制： 称取半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖标样0.10g，分别溶于100mL容量瓶中，配制成1000mg/L标准储备液。 超纯水稀释储备液分别配制半乳糖、葡萄糖、甘露糖浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、 40.0 mg/L和果糖浓度为4.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L的标准溶液。 （2）样品溶液的配制： A．粗多糖的提取： 分别取20 g绿茶、普洱茶、乌龙茶、红茶粉碎后，水浴加热250 mL温水浸提120 min，超声波辅助浸提，用布氏漏斗抽滤后，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，温度控制在70℃，浓缩至10 mL左右，用三倍体积95%乙醇沉淀，放置冰箱冷藏，静置过夜后抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚交替洗涤2次，放置于恒温箱中低温干燥至恒重（70℃）。 B．粗多糖的水解： 本实验利用超声辅助乙酸水解法，分别称取上述四种茶叶粗多糖0.2 g，用50 mL1mol/L 乙酸水解，超声波作用时间为120 min。同时尝试了直接用水水解，但试验效果不佳。 2 结果与讨论 2.1 淋洗液的选择： 调节淋洗液NaOH浓度分别为1.0、2.0、5.0、6.0、7.5、10.0、15.0、20.0、50.0、100.0、 200.0 mmol/L，分析含有半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖4种单糖的标准溶液。由于半乳糖、 葡萄糖和甘露糖属于差相异构体和位置异构体，流动相的浓度应小于20.0 mmol/L，才可使这三种单糖达到分离。通过对比发现在NaOH浓度为6.0 mmol/L时，4种单糖峰分离效果最好，且保留时间适中。但是，在低浓度的条件下，由于脉冲安培检测器是在碱性条件下（pH12）的电化学响应下实现的，所以检测的灵敏度降低，重现性变差，且每次进样前色谱柱需要再生处理，用高浓度氢氧化钠（200.0 mmol/L）平衡柱子。 2.2 标准曲线的绘制与最低检测限的测定 在优化的分离测定条件下，分析标准溶液，以峰高定量，其分离情况见图1。 图1 4种单糖标准样品的色谱图（半乳糖、葡萄糖、甘露糖20 mg/L，果糖30mg/L） 以单糖的色谱峰高（Y）对其质量浓度（X，mg/