PPO测定参考上海市植物生理学会所编著方法.docVIP

PPO测定参上海市植物生理学会所编著方法[。5g果肉加10ml pH6.8磷酸缓冲液、少量PVP和石英砂，冰浴中快速研磨成匀浆，12000rpm，4℃，离心5min，上清液为PPO粗酶液。酶促反应体系包括0.5ml粗酶液、3.5ml磷酸缓冲液、1ml 0.1mol·L邻苯二酚、以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.4 漆酶活性测定 。取5g果肉加10ml pH5.0醋酸缓冲液，冰浴中快速研磨成匀浆，12000rpm，4℃，离心5min，上清液为漆酶粗酶液。0.2ml粗酶液加入1.8ml醋酸缓冲液、1ml 5μmol·L-1 ABTS(λ420处消光系数：3.6×104M-1cm)，以缓冲液代替粗酶液在相同条件下测定为对照，测定3min内420nm波长处吸光值变化，以1min氧化1μmol·LABTS的酶量最为一个酶活力单位。3.4.5 PPO最适pH 以PPO活性高峰期的砀山酥梨果实为材料，提取粗酶液。在不同pH值（pH3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.8、7.0、7.6、8）磷酸缓冲液各3.5ml中加入1ml 0.1mol·L邻苯二酚，0.5ml粗酶液，以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.6 PPO最适温度 以PPO活性高峰期的砀山酥梨果实为材料，提取粗酶液。取3.5 ml pH6.8磷酸缓冲液加入0.1mol/L邻苯二酚，分别于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃水浴20min，然后分别加入0.5ml粗酶液，以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.7 PPO最适底物浓度 以PPO活性高峰期的砀山酥梨果实为材料，提取粗酶液。将0.5mL酶液、3.5mL磷酸缓冲液中，分别加入1mL浓度为0.02mol·L、0.04mol·L、0,06 mol·L、0.07 mol·L、0.08 mol·L、0.1 mol·L、0.12 mol·L、0.14 mol·L、0.16 mol·L、0.18 mol·L、0.2 mol·L的邻苯二酚，以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.5 mol·L-1、1.0 mol·L-1）的EDTA、抗坏血酸、柠檬酸、山梨醇、蔗糖试剂，3.5 ml上述试剂中加入0.5ml粗酶液1ml 0.1mol·L-1邻苯二酚、以煮沸失活粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照，测定1min内420nm处吸光值变化，以反应曲线的最初直线部分计算酶活，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。3.4.9 改良CTAB法提取RNA 总RNA提取参照樊洪泓方法[]。 (1) 取适量梨果实组织，加入适量的PVP，加液氮充分研磨至粉末状，转移至2ml离心管中，加入20-30μl β-巯基乙醇和1ml 65℃预热的提取缓冲液，剧烈震荡混匀65℃温浴15min； (2) 于4℃ 12 000 rpm 离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中； (3) 加入等体积酚（pH 4.5）：氯仿：异戊醇（25:24:1），剧烈震荡，于4℃12 000 rpm 离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中； (4) 加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）剧烈震荡，于4℃ 12 000 rpm 离心10min，将上清液转移至另一新的2ml离心管中（重复此步骤，直至界面干净）； (5) 加入1/3体积的10mol·LLiCl，℃过夜，于4℃ 12 000 rpm离心10min； () 用75％乙醇洗沉淀2次，沉淀于室温风干，加入50μDEPC水，充分溶解后，于-70℃保存备用。 3.4.1 引物的设计 利用DNAS软件，对GenBank上已登录的PPO基因，如果、杏、水稻等氨基酸序列进行多重比对，比较氨基酸序列的同源性，在其中间隔长度适宜8个连续相同氨基酸的高度保守序列，分别VHCAYCD和DPVFYAH，设计一对引物：3’RACE反应和5’RACE反应所需的巢式引物：特异性引物3’special outer primer、3’special inner primer和特