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四、RNA干扰的研究方法 3. 用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。 这种方法—制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”?就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA?，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。 在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。 不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因，虽然现在多数的研究显示这种情况通常没有发生。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 4.利用质粒或病毒载体表达siRNA 多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。 之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。 使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 siRNA表达载体的构建 四、RNA干扰的研究方法 由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。 不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。 siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。适用于长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。 siRNA的制备 除质粒载体外，科研人员已经成功地采用逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体将表达siRNA的DNA模板序列转移入哺乳动物细胞。现在许多学者正在加紧腺病毒载体的siRNA转移研究 。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5. PCR方法制备siRNA的表达框架 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。 和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。 因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。 四、RNA干扰的研究方法 如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接构建siRNA表达载体。 构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长期研究。 主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。 最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子； 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。 siRNA的制备 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5种siRNA制备方法的比较 四、RNA干扰的研究方法 si