IL-33TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用教程分析.docVIP

IL-33/TLRs信号通路在A549细胞上皮-间质转化中的作用 摘要 目的 观察生长转化因子β1（TGF-β1）对上皮来源的A549细胞增殖及相关细胞标记物的影响，探讨IL-33/TLR4信号通路在上皮来源的A549细胞上皮-间质转化中的作用。 方法 培养A549细胞，用5ng/ml的TGF-β1刺激A549细胞；在不同时间点，MTT法检测TGF-β1对A549细胞增殖的影响；Real-time PCR方法检测IL-33/TLR4信号通路中关键因子IL-33，TLR4、PI3K基因的表达改变；western blot方法检测α-SMA， E-cad， p-AKT蛋白的动态表达。 结果 （1）.MTT结果显示，各组细胞生长良好，随时间的延长，细胞数量逐渐增多，但加入5ng/ml TGF-β1刺激12h，24h，48h后，A549细胞的增值与对照组相比，无统计学意义（P0.05）。 （2）.在5ng/ml的TGF-β1刺激下，A549细胞与对照组相比，E-cad蛋白表达量逐渐下降（P0.05），而α-SMA的表达呈逐渐上升的趋势（P0.05）。提示，A549细胞上皮细胞特征逐渐减少，而间质细胞特征逐渐增多，即A549细胞发生了上皮-间质转化。 （3）. Real-time PCR结果显示，经5ng/ml的TGF-β1处理的A549细胞与对照组相比，在12h、24h、48h，IL-33/TLR4信号通路的关键基因IL-33、TLR4均呈先升高后下降的趋势，在24h时表达量最高，差异有统计学意义(P0.05)。 （4）.western blot结果显示，经5ng/ml的TGF-β1处理的A549细胞，随时间的延长，在12h、24h、48h，p-AKT的表达量逐渐升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P0.05)。 结论 （1）5ng/ml的TGF-β1刺激A549细胞后，上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达逐渐降低，间充质细胞标志性蛋白α-SMA表达逐渐升高，即TGF-β1诱导A549细胞过程中存在上皮-间质转化（EMT），提示EMT与纤维化病变密切相关。 （2） 在TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化过程中，存在IL-33、TLR4等的过表达，提示IL-33/TLR4信号通路发挥了作用。 （3） 在EMT过程中，PI3K/AKT信号通路被激活，TLR4能与PI3K结合，而TLR4的激活依赖于IL-33，故推测PI3K/AKT信号通路的激活与IL-33的过表达有关。 （4）EMT过程中，存在IL-33、TLR4呈先升高后下降的趋势，提示肺组织受损伤后，IL-33作为警报素，启动肺组织的自我修复，参与了肺纤维化的形成。 关键词 上皮-间质转化 (EMT)；白细胞介素-33（IL-33）； Toll样受体（TLRs）；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）。 Abstract Objective: To investigate the effects of A549?cells on the cell proliferation?of epithelial origin?and related?cell markers by TGFβ1.To investigate the role of?IL-33/TLR4?signaling pathway in A549?cells in epithelial?mesenchymal transition Methods: Cultured A549 cells were treated by TGFβ1 (5ng/ml).The effect of proliferation of A549 was detected by MTT at different time. The expression of the key factor IL-33、TLR4、PI3K in the IL-33/TLR4 signal pathway was determined by Real-time PCR. The dynamic protein expression of α-SMA、E-cad、p-AKT was determined by western blot analysis. Results: (1) MTT results showed that the cells grew well in every group. With the prolongation of the time,?the cells?gradually increased in number. But with the addition of TGFβ1(5ng/ml) stimulates 12h、24h、48h