动物细胞制药的前景与展望！.ppt

已分化的成年细胞核等多种细胞的核可以是全能性的含转移核的卵母细胞从发育至羔羊出生,所需遗传信息的修饰是可逆的（最初的目的） * 转基因动物的鉴定 整体水平检测 从遗传学上对动物整体水平进行生物学特性研究，如生长速度，繁殖周期等；2）对转基因动物器官，组织细胞的结构和功能方面分析； 翻译水平 采用酶联免疫吸附试验和质谱技术检测是否表达；采用生物化学方法检查产物活性。 转录水平 检验外源基因是否表达mRNA 染色体和基因水平 检测子代动物基因组是否整合外源基因，以及整合的位点和拷贝数。可用PCR法 * 转基因动物的利用 在生物制药方面的应用-动物生物反应器 转基因动物制药可以生产出具有医用价值的生物活性蛋白质。一般通过以下五个途径 1）血液，1992年Swanson制备血液中含有人血红蛋白的转基因猪。 2）膀胱，1998年，Kerr获得尿液表达生长激素的转基因小鼠。 3）鸡蛋清，周期短，产量大，逐步成为开发医用和营养蛋白的一种有效途径 4）乳腺，1987年，Gordon建立第一例乳腺生物反应器小鼠表达组织纤溶酶原激活剂，溶解血栓有显著疗效。 5）蚕茧 * 在医学研究中的应用 建立人类疾病模型，目前已建立人胰岛素的转基因小鼠模型和人类发病机理相似的阿尔茨海默症转基因动物模型。 异体器官移植，利用转基因动物培育人体器官，缓解供需矛盾。目前正在做工作。 在动物育种方面的应用 可以提高动物生长率，产毛性能，抗寒能力，改变牛奶成分，抗病能力等，挽救濒危动物 * 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells） 2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究 他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。 优点：与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。 利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专有的干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。 2012年10月8日，John B. Gurdon 与 Shinya Yamanaka 因此获得诺贝尔生理学和医学奖。 * 体细胞核移植法 将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，以这些动物体细胞为核供体。通过显微操作或者电融合使供体与受体（去核的原核胚或成熟卵母细胞）不经过有性繁殖阶段，在体外直接进行重组融合，进行胚胎移植，进而得到转基因动物。 克隆羊“多利”的诞生 * 体细胞核移植法 将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，以这些动物体细胞为核供体。通过显微操作或者电融合使供体与受体（去核的原核胚或成熟卵母细胞）不经过有性繁殖阶段，在体外直接进行重组融合，进行胚胎移植，进而得到转基因动物。 克隆羊“多利”的诞生 * 实验最初是用来验证人们关于基因组在发育和分化、成熟过程中没有发生不可逆修饰的设想 * 从注射了促性腺激素释放激素28～ 33小时的苏格兰黑脸母羊中取得卵母细胞( oocyte) ,并尽快去除核。 供核细胞则有三种来源: ( 1) 9日龄的胚( embryo )细胞; ( 2) 26日龄的胎儿( fe tus)成纤维细胞; ( 3)孕期最后三个月的6岁龄母羊乳腺上皮细胞。 通过将细胞培养液中血清浓度从10%降至0. 5% ,并持续5天,产生处于G0 期的二倍体供核细胞（供核细胞的处理） 去核卵母细胞与供核细胞的融合及卵母细胞的激活,是通过相同电脉冲完成 胚胎在6天后发育成桑葚胚或胚泡后转移至第三只母羊中发育至羔羊出生 总共62%的胎儿流失,显著高于正常交配怀孕的6%流失率 所有三种供核细胞都生出了羔羊,共8只。其中一只由成年羊的体细胞提供核出生 的羔羊,在哺乳动物是首例。 转基因动物鉴定 所有羔羊均显示出供核羊的形态特征,而未显示卵母细胞供体的形态特征,这说明羔羊不是卵母细胞供体或第三只羊意外交配的产物 对所有羔羊及三个细胞群在四个多形位点的DN A微卫星分析证明: 每只羔羊均来源于做为供核者的细胞群