生物技术导论作业.doc

得 分 统分人 学习目的： 知道基因工程的含义 掌握基因工程的主要内容和步骤 了解基因工程的应用 教学重点： 基因工程的主要内容 教学难点： 基因工程的步骤 讲明内容： 基因工程的含义 基因工程的含义 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 获取目的基因 基因：具有完整遗传信息的DNA片段。 目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因称为目的基因。目的基因一般是结构基因，也就是能转录和翻译出多肽（蛋白质）的基因。 1.目的基因的获取方法 ① 酶切分离法直接分离目的基因 质粒和病毒等DNA分子小，编码的基因较少，已测序的DNA分子，已克隆在载体中的目的基因，用适当的限制性内切酶酶切，可获得目的基因。 ② 利用PCR扩增目的基因 如果知道目的基因的全序列或其两侧的序列，可以通过合成1对与模板DNA互补的引物，可利用PCR扩增目的基因。 ③ 化学合成目的基因 根据某基因测定的核苷酸序列，或者根据蛋白质氨基酸序列 推导的核苷酸序列，DNA合成仪自动地将游离脱氧核苷酸合成相应的基因。 ④ 通过构建基因组文库或cDNA基因文库分离目的基因 基因组文库： 把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。 cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种 cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库。较高等的生物在特定发育阶段或特定器官表达的基因有所不同（基因的时空表达），所以用特定发育阶段或特定器官的材料构建的cDNA文库通常是部分 cDNA文库。cDNA文库的一个克隆子包含一个基因的全部编码序列，不含内含子、转录启动子和终止子的核苷酸序列，所以使用从cDNA文库中获得的目的基因时，在其两侧必须组装上转录启动子和终止子等元件。 从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因(最直接的方法):根据目的基因已知的核苷酸序列制备核酸探针，对基因组文库或cDNA文库的一系列克隆子的DNA分子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因（阳性克隆子）。 目的基因与载体结合 载体的选择 ①能在宿主细胞内复制并稳定的保存，能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或能停留在细胞质中进行自我复制，或能整合到染色体、线粒体和叶绿体DNA中，随这些 DNA同步复制。 ②具有多个限制酶切位点（多克隆位点），在克隆载体合适的位置必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多，便于多种类型末端的DNA片段的克隆。 ③具有某些供选择转化子的标记基因 如：氨苄青霉素抗性基因(apr或ampr)、氯霉素抗性基因(cmr)、卡那霉素抗性基因(kmr或kanr)、链霉素抗性基因(smr)、 四环素抗性基因(tcr或tetr)等， 蓝白筛选(β-半乳糖苷酶基因)，报告基因：gus (β-葡萄糖苷酸酶 )、gfp (绿色荧光蛋白基因)等。 ④克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。 目的基因与载体结合 用与目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与质粒切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。 (三) 目的基因导入受体细胞 重组DNA分子只有进入适宜的受体细胞后才能进行大量的扩增和有效的表达。原核生物细胞和真核生物细胞可作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。 选择受体细胞 1）便于重组DNA分子的导入； 2）便于筛选克隆子； 3）重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持； 4）对遗传密码的应用上无明显偏倚性； 5）遗传稳定，易于扩大培养或发酵。 1.重组DNA转化大肠杆菌 2.大肠杆菌质粒转化农杆菌 3.基因转化植物的方法 ①脓杆菌转化法 ②基因枪法 ③电击法 ④花粉管通道转化法 （四）目的基因的筛选与鉴定 对转基因生物进行筛选鉴定是基因工程的必须环节，近年来各种转基因生物的筛选鉴定技术已发展成熟。 1. 利用抗性基因及报告基因进行筛选 目前最常用的筛选基因是新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）， 使用该基因转化植物，可以赋予转化细胞抗卡那霉素、庆大霉素、G418（一种氨基糖苷类抗生素）的能力，因此被广泛应用于植物遗传转化中。另