多沙唑嗪对映体在动物心血管系解析：.ppt

Agilent 1260 液相色谱系统（荧光检测器，四元泵，自动进样器） 色谱柱:Ultron ES-OVM手性柱(150 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm, Shinwa, Japan) 流动相: 磷酸盐缓冲液(20 mM, pH 5.32)-乙腈 (86: 14 v/v) 流速: 1.0 mL/min 柱温: 30 °C 检测光谱:激发波长255 nm，发射波长385 nm 哌唑嗪, (-)DOX 和(+)DOX保留时间分别为6.2 min, 10.0 min 及 11.3 min. 色谱条件 血浆蛋白浓度分析 BCA?蛋白含量检测试剂盒(Multisciences Biotech Co. Ltd, Hangzhou, China)分析混和血浆蛋白浓度. 试管中加入50ul稀释血浆(稀释100倍）及Bradford 试剂(1.5 mL) ，37°C 震荡混匀。 TU-1901 UV-VIS 紫外分光光度计在562 nm处测吸光度。 以BSA 制作标准曲线测定样品的蛋白浓度。 蛋白结合研究 平衡透析过程 依照说明书准备半透膜：煮沸去离子水浸泡20 min, 30% 乙醇浸泡20 min. 去离子水冲洗, PBS浸泡 60min. 500ul 血浆置于2cm长半透膜透析袋中，两端结扎，透析袋放入5 mL试管（内含 200, 400 or 800 ng?mL-1 (±)DOX的 PBS 缓冲液3mL）. 密闭， 37 °C温育15 h. HPLC法测定透析袋内及试管内药物浓度（各取5份样品）。 PBS 缓冲液样品处理 取400 μL 透析液加入 20-μL 内标溶液 (prazosin 1 μg?mL-1) 加入900 μL正己烷－乙酸乙酯(1: 1, v/v). 涡旋2 min, 6000 rpm离心4 min. 取上清移入另一试管，氮气流吹干 200 μL 流动相复溶. 取10 μL进样分析，检测游离药物浓度 透析袋内样品处理 取100 μL 透析袋内容加入 20μL 内标溶液(prazosin 2 μg?mL-1) 及900 μL正己烷 －乙酸乙酯 涡旋2 min, 6000 rpm离心4 min. 取上清移入另一试管，氮气流吹干 200 μL 流动相复溶. 取10 μL进样分析，检测总药物浓度 结 果  采用高效液相色谱法手性分离血浆及PBS中的(±)DOX，专属性良好，内标（哌唑嗪）、(-)DOX和(+)DOX达到基线分离，最低检测限为0.2 ng·mL-1（S/N≥3）。 多沙唑嗪对映体在血浆、PBS中的浓度范围分别是50～1600 ng·mL-1、12.5～200 ng·mL-1，多沙唑嗪对映体的浓度与峰面积呈良好的线性关系（r 0.9990）。 多沙唑嗪对映体在血浆和PBS的日内、日间精密度分别小于3.2%、6.3%，回收率为90.5%～102.4%，实验过程中稳定性良好。 方法学验证  在PBS中加入800 ng·mL-1的消旋多沙唑嗪，与混合人血浆进行平衡透析，分别在0、4、8、15及20h取样分析。 试验表明，37°C时，(-)DOX和(+)DOX迅速通过半透膜，在15h达到稳态水平。 犬与大鼠的血浆平衡时间与人血浆相近。 平衡透析条件的优化  (-)DOX在三个不同种属血浆中的蛋白结合率为89.4%～94.3%，(+)DOX为90.9%～95.4%。 在三种血浆中， (+)DOX的结合浓度（Cb）均大于(-)DOX的Cb（P0.05），并且这种差异随多沙唑嗪浓度的增加而变得更加明显。 犬血浆中比在人或鼠血浆中更为明显。 人、犬、鼠的血浆中多沙唑嗪对映体的蛋白结合力均体现了立体选择性，(+)DOX的蛋白结合力均高于(-)DOX。 Percentage of plasma protein binding of (-)doxazosin and (+)doxazosin in rat, dog and human as determined by equilibrium dialysis at 37°C and chiral HPLC 200 ng·mL-1 400 ng·mL-1 800 ng·mL-1 (-)doxazosin (+)doxazosin (-)doxazosin (+)doxazosin (-)doxazosin (+)doxazosin Rat 89.35±1.30 90.97±1.19 92.31±0.19 93.73±0.20 92.34±0.43*△ 93.66±0.37* Dog 90.85±0.87 93.08±0.68 91.05±1.91** 93.25±1.50* 90.52±1.03** 92.72±0.