血浆氨测定.解读.pptVIP

酶法测定血浆氨 华中科技大学附属协和医院检验科 Michaelis 和 Menten 根据 Henri 提出的酶-底物复合物学说,推导了单底物酶促反应方程 酶促反应进程曲线 　连续监测法反应曲线 A单试剂连续监测法　　　 B双试剂连续监测法 实验目的 掌握酶法测定血浆氨的原理及方法 熟悉工具酶的概念及应用 了解血浆氨测定的临床意义 实验原理 NH3+ H ++ NADH + α-酮戊二酸 GLDH L-谷氨酸 +NAD+ + H2O 氨在谷氨酸脱氢酶的作用下与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸,并将NADH 氧化为NAD+,测定 在340nm波长处的吸光度下降值，通过与标 准品340nm处吸光度的下降值比较,计算测定样本中氨的浓度。 测定条件（基本操作参数) 测定步骤 试剂R1加5ml新鲜去离子水溶解10min混匀 结果计算 △A 标准=(A1-A2)标准-(A1-A2)空白 △A样品=(A1-A2)样品-(A1-A2)空白 氨浓度（umol/L）=△A 样品/△A 标准×标准浓度 血氨标准液=58.8 umol/L 临床意义 肝昏迷的监测 儿科Reye综合症的诊断 注意事项 准确加样 严格控制反应时间 准确读数 避免氨污染 * * 工具酶 定义： 工具酶：作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓 度的酶。 工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类 分类： 底物浓度测定 与酶活性测定类似,利用酶催化反应的高效率和 专一性，可以测定底物浓度 测定方法 按照对酶促反应时间的选择不同 连续监测法 固定时间法 （一）固定时间法 分类： 终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法：该方法反应时间的预定是从t1～t2 。 定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。 终点法特点： 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 注意：固定时间法时间段的预定不宜太长 （二）连续监测法 原理： 定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。 特点： 缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。 优点: 能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。 1cm 90S 比色光径 读数时间 340nm 37℃ 2:1 两点法 测定波长 实验温度 试样比例 测定方法 各管混匀，20S和100S时读取各管吸光度值 60ul 60ul 60ul Ｒ２ 各管混匀，37℃水浴放置10分钟 1.5ml —— —— —— 1.5ml —— —— —— 1.5ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml Ｒ１ 蒸馏水 标准 样品 样品管 标准管 空白管 * * *