基因文库概述.pptVIP

第九章 基因文库 第一节 基因组文库 第二节 cDNA 文库 第三节 基因文库筛查 将某种生物细胞的基因组或染色体DNA的所有限制酶切片断(或机械剪切片段)随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成含各个随机片段的一系列无性繁殖系 (DNA克隆)，当DNA克隆数目足以包括该种生物的全部基因时，这些克隆的总体就称为该种生物的基因文库. 每一DNA克隆内所包含的靶DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分, 或完整基因及其两侧的邻近序列, 或非编码序列. 基因文库与基因库的概念不同. 基因库是指某种生物的全部基因, 是基因的总和; 而基因文库是某种生物基因组DNA的全部随机片段, 是序列信息的总和. 第一节 基因组文库 基因文库是整个基因组的不同DNA片段的集合体, 每个片段被分别构建成为DNA克隆, 这些克隆的总体称为基因文库. 由基因组DNA为起始材料所构建的基因文库称为基因组文库; 由cDNAs 为起始材料所构建的基因文库称为 cDNA文库. 好的基因文库相对于起始材料应有足够的代表性, 也即是在DNA的分离提取及克隆操作过程中不会丢失某些必要的序列. 由于cDNA文库来源于总mRNA, 所以基因组文库包含的序列信息远远大于cDNA文库. 1. 代表性文库 理论上, 一个基因组文库应包括基因组DNA的全部序列. 一个高质量的基因组文库应包含尽可能多的起始基因组DNA序列. 若一个基因组文库所包含的克隆数目不够多, 就有可能使某些序列丢失. 基因组文库所需的克隆数与文库含有各个序列片段的概率之间关系可用下列公式表示: N = ln (1- P)/ln (1- f) N----所需克隆数; P---文库含各序列的概率 f ---随机片段占基因组的比例 如果E. coli 随机片段的大小为 20 kb, 要求含有各序列的概率为 0.99, 其基因库的克隆数应为: N = ln(1-0.99)/ln(1- 2×104/4.6×106) = 1100 若以同样的片段大小和概率构建人类的基因文库, 则所需克隆数为: N = ln(1-0.99)/ln(1- 2×104/3×109) = 690000 减少所需克隆数的方法是增加克隆片段的长度. 因此, 应根据起始基因组的大小, 选容量合适的基因载体. 即大的基因组应选用容量较大的基因载体,如BACs和YACs; 小的基因组可选用容量较小的基因载体, 如质粒、噬菌体载体、Cosmids等. 2. 构建基因组文库的程序: ? 基因组DNA 分离提取 组织细胞 →研磨萃取 →分离基因组DNA →DNA纯化 ? 重组体DNA制备与转化 基因组DNA ─┳→ 随机片段 ─┬→ 重组体DNA 限制性内切酶┛ 基因载体 ┛ ↓ 转化 ↓ 细胞培养(液体) ↓ 基因组文库←平板培养 第二节 cDNA 文库 ? cDNA文库是cDNA克隆的集合体, 每个cDNA克隆的靶DNA来自总mRNA反转录产生的一个随机cDNA分子, 这些cDNA克隆构成文库. ? 总mRNA是基因组转录的产物, 有时空特性, 即特定组织细胞在特定生长发育阶段或特定环境中的基因表达, 故cDNA文库也称表达文库. ? 特定组织细胞在特定发育时期或特定环境条件下的总mRNA也称为转