分子标记术之RAPD标记精要.pptVIP

（一）RAPD 的原理 RAPD（random amplified polymorphism DNA, 随机扩增多态性DNA）标 记技术是利用人工合成的约10bp的随机序列寡核苷酸作引物，以生物的 基因组DNA为模版，进行PCR扩增，该单引物可能和基因组DNA有许多个 结合位点，当两个结合位点之间的DNA片段长度符合PCR反应条件时即可 被扩增。产生不连续的DNA产物， 通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 序列的多样性。不同来源的DNA， 具有不同的DNA引物结合位点从 而RAPD反应中获得不同的扩增产 物，扩增产物再经凝胶电泳分离， 生物基因组的分析；?技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技 术；?DNA样品需要量少，这对于生物早期取样的情况大有益处；引物 价格便宜，成本较低；?RAPD易发生多态性，广泛用于物种分类鉴定、 遗传连锁图谱的建立、基因定位、杂种优势分析和标记辅助选择等。 RAPD标记也具有许多不足：?RAPD一般为显性标记，无法区分从一个 位点扩增的DNA片段是纯和的还是杂合的，无法进行等位基因分析； ?RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高；?存在共迁移问题，在 胶上看到的一条带有可能包含了非同源的扩增产物，因为所用的凝胶电 泳类型（一般是琼脂糖凝胶电泳）只能分开大小不同的片段，而不能分 开有不同碱基序列的片段，引物的筛选费时费力，染色剂溴化乙锭是一 种强诱变剂，对人体有毒；?目前该法在引物长度和序列及应用的引物 数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果 的可比性；?每个标记含有的信息量少；?有假阳性和假阴性结果； ?用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离等。 3.RAPD标记具体实例 1.RAPD标记分析技术获得桃果实的有毛（G）性状基因RAPD标记，具体是这样进行的： * 分子标记术之RAPD标记 目录 RAPD标记的原理与特点 1 RAPD标记的技术操作 2 RAPD标记应用举例 3 一、RAPD的原理与特点 PCR标记（PCR markers）是随着PCR技术诞生和发展而产生的第二代分子标记技术。PCR技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法。该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数百万倍。 根据PCR引物的不同，可将PCR标记分成两种类型：?PCR反应中采用随机单引物扩增，如RAPD?通过克隆和测序而构建特异双引物，然后对基因组DNA进行扩增，包括SSR、STS等。 图一、RAPD的原理及示意图 溴化乙锭（EB）染色后即可观察分析。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失和碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。 （二）RAPD的特点 RAPD技术与PCR技术相比较，RAPD需要一个10bp寡核苷酸随机引物，而常规PCR需要2个20bp左右的特定设计引物；RAPD退火温度一般是36℃左右，一方面保证引物与模版DNA的稳定配对，同时允许适当错误配对，提高多态性检出率，常规PCR为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。与其他分子标记相比，RAPD标记具有许多优越之处：?试验步骤少，省力省工、进度快，没有物种特异性，不需要预先知道基因组的任何分子信息，同一套引物可用于任何植物的研究，具有广泛性和通用性；?不需要DNA探针，设计引物也无需知道序列信息，可用于任何 二、RAPD技术的操作 1.技术路线 RAPD的技术路线图如图 RAPD标记技术的操作过程 选择随机引物 选择随机引物 DNA的提取 PCR反应 凝胶电泳 图谱分析 2.仪器设备和消耗品 电泳槽 DNA扩增仪 电泳仪 离心管 移液器吸头 紫外线观察装置 移液器 照相设备 3.试剂 随机引物 （10bp） (5umol/L) 5×TBE 缓冲液 500mmol/L KCl 25mmol/L MgCl2 Taq酶（附带10× PCR缓冲液） 100mmol/L Tris.Hcl ph8.3 1.4％琼脂糖凝胶 （含溴化 乙锭0.5ug/uL） dNTPs (2.5mmol/L) DNA分子量标记 （?DNA/EcoR I ＋Hind双酶切） 4.操作步骤 超净台上，依次在冰上向无菌的0.5mLEppendorf离心管中加入 1 在加热至90℃的PCR仪中预变性94℃ 2min， 然后循环：94℃ 1min，36℃ 1min， 72℃ 1min，共40轮循环。 2 循环结束后，72℃ 10min，4℃保存。 取PCR产