第一章节酶的纯化方法解析.pptVIP

如何进行酶的活力测定： (1)如果待分离的酶已有报导，可参考它所采用的测定方法和条件； (2)如果需要另建新的测定系统，那么就得先对该酶的作用、动力学性质等有所了解，据此来选择合适的底物和底物浓度、以及最适的反应pH和温度等，同时确定一种相应的测定方法。 测酶活时的注意事项: 一是测定用的酶反应时间应选择在酶反应的初速度范围内； 二是测定用的酶量必须和测得的活性有线性关系。 纯化过程中的酶活力测定还应考虑三个问题： (1)由于测定工作量校大，而且有时“立等”结果，所以要求测定方法快速、简便，而准确度在一定程度上比较次要，甚至可容许5—10％的误差，故常用分光光度法、电学测定法等测定; (2)由于分离纯化过程可能丢失辅助因子，因此有时需要在反应系统中加入相应的物质，如煮沸过的抽提液、辅酶、盐或半脱氨酸等； (3)由于纯化过程中引入的某些物质可能对酶的反应和测定有影响或干扰，故有时还应在测定前进行透析或加入螯合剂等。 测定酶活力的表示方法: 酶的活力通常采用国际酶学委员会规定的单位表示，但是在纯化工作中，为了方便，也可采用自行规定的单位，如直接以光密度值表示.从酶的活力测定得到的直接结果是样品中酶的浓度，即单位数／毫升。 由此进一步算出样品中总的单位数，即总活力;以及单位重量的蛋白质中酶的单位数，即比活力，如单位数／毫克蛋白，或单位数／毫克蛋白氮。 测蛋白含量常用的方法有： (1)紫外吸收法，此法简便快速，不损耗样品，但干扰因素很多； (2) 双缩脲法, 较简单； (3)酚试剂法, 较复杂，但灵敏度、准确度都比较高。 (4)蛋白质通常采用凯氏定氮法。 一般比活力愈高，酶的纯度也较好，但是它不能说明实际的纯净程度是多少。 （二） 纯化方法与条件的比较标准 在酶的分离工作中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后酶的得率或回收率(y)； 比活力则用于计算某一纯化步骤的纯化效果，即纯度的提高(e)。 y(收率) = —————————— 某步骤前的总活力 某步骤后的总活力 e(纯度提高) = —————————— 某步骤前的比活力 某步骤后的比活力 抽提或纯化某步中，如果有多种方法或条件可供选择时，一般采用下式进行权衡： loge＝logE·logy／logY e和y分别表示用某种方法或条件进行一次纯化后纯度的提高与回收率；G和Y分别表示用上述方法或条件重复多次后总的纯度提高与总的回收率，这两项是推算出来的。 例如，有A、B二种方法或条件可供选择，用A法重复n次以后可得到Ea和Ya；以Ea为标准，用B法要得到同样的Ea，需要重复n次，由此就可算出相应的Yb．比较Ya和Yb就能作出判断。 三 纯度的标准 纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定。 酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法: 1．溶解度法 这是老方法，由于所需样品量较大，已很少采用． 2.电泳法 常用的有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺不连续胶电泳和聚焦胶电泳，特别是后二者有极高的分辨力。 3.超离心法 在高达65，000rpm的离心力场情况下观测离心谱带，根据沉降峰带是否分裂、是否有“肩”、是否对称等可以作出均一与否的判断。 4．免疫学法 纯化的酶样品在琼脂胶上与相应的抗体 进行免疫反应，根据得到的沉降线可以判 断样品的纯度。如果此法以免疫电泳的方 式进行，则更为灵敏。 第四节 酶的剂型与保存 为适应各种需要，并考虑到经济和应用效果，酶制剂常以四种剂型供应： 1.液体酶制剂 2.固体粗酶制剂 3.纯酶制剂 4.固定化酶制剂 一. 液体酶制剂 制备与应用: 这包括稀酶液和浓缩酶液。一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用． 特点: 比较经济，但不稳定，而且成份繁杂. 二. 固体粗酶制剂 制备与应用: 这类制剂有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成；有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成;有的则加材淀粉等填充料。这些制剂多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。这类制剂中也有的是在发酵液或抽提液除去杂质，并经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物等生产的酶制剂。 特点: 固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。 三. 纯酶制剂 用途:包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位重