DNA测序原理及数据分析概述.pptVIP

DNA模板用量 DNA模板定量方法 测序PCR循环参数设置 96℃ 1min 96℃ 10sec 50℃* 5sec 25个循环 60℃ 4min 4℃保存 *根据引物Tm值的不同，退火温度可设置为45～55 ℃ 测序反应主要影响因素 DNA模板 －浓度 －纯度 引物 测序试剂 PCR仪 测序产物纯化方法 DNA浓度的影响 模板过多过少导致测序结果头重脚轻，序列不长 模板和引物的平衡是关键 对DNA纯度的要求较高 PCR产物一定要经过纯化后再测序 琼脂糖凝胶电泳查看有无杂带－割胶回收 测序反应体系中，尽量减小模板DNA体积以减少杂质 引物的选用 靶DNA片段克隆于载体中 采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物 PCR产物直接测序 需要选用与靶DNA序列互补的引物 引物设计原则与普通PCR引物设计原则相同 引物影响因素：引物纯度、错配、引物二聚体、 引物二级结构等 测序成功的图谱 测序失败的图谱 引物因素 引物二聚体 模板上没有引物结合位点 钉子峰 * DNA测序原理 及数据分析 茅海燕 浙江省疾病预防控制中心 主要内容 原理： DNA测序原理 全自动DNA测序仪 应用： DNA测序用途及策略 DNA测序流程及影响因素 分析： 数据转换 序列拼接软件 DNA测序原理 双脱氧链终止法（Sanger法,1977) －同位素标记 －荧光标记法 标记引物 （Primer） 标记终止物（ddNTP） 化学降解法（Maxam-Gilbert法) 由此获得Nobel奖的Sanger先生 双脱氧链终止法的特点 利用了DNA的体外合成过程 （模板、引物、Taq酶、dNTP等） 反应体系中含有DNA合成终止物－－ddNTP －可以当作正常碱基参与复制 －一旦掺入DNA中，DNA合成终止 反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段 dNTP、ddNTP结构 dNTP ddNTP 缺少一个羟基 测序示意图 同位素标记 四种终止物必须在4个PCR管中进行反应 四管反应，四道电泳 时间长 序列短 污染大 操作难 四色荧光标记在引物上 电泳 四色荧光标记在终止物上 四种混合物可以在一个PCR管中进行反应 只需一道电泳检测 测序反应与PCR的差异 测序只用一条引物，PCR需要两条引物 测序反应需要加入dNTP和ddNTP,PCR反应只需dNTP 测序产物线性增长，PCR产物指数增长 测序反应产物是长度相差一个碱基的一系列多核苷酸片段，PCR产物是长度相同的一种片段 主要内容 原理： DNA测序原理 全自动DNA测序仪 应用： DNA测序用途及策略 DNA测序流程及影响因素 分析： 数据转换 序列拼接软件 DNA测序仪组成 主机 电脑及软件 试剂与耗材 DNA测序仪基本构造 进样 荧光激发 电进样及电泳 毛细管和电极同时插入样品中 通高压电 带负电荷的DNA在电场作用进入毛细管并向另一侧的正极段移动 荧光激发和检测 带四色荧光标记的DNA片段从小到大依次经过激光检测区 激光激发荧光产生特定波长的荧光信号 荧光信号被冷CCD收集 分析软件可以将光学信号转换为电泳图谱 测序数据 主要内容 原理： DNA测序原理 全自动DNA测序仪 应用： DNA测序用途及策略 DNA测序流程及影响因素 分析： 数据转换 序列拼接软件 DNA测序仪的基本应用 测序应用（genesequence） 对目标DNA进行碱基的序列测定，并在此 基础上，进行各种相关分析。 片段分析应用(genescan） 在测序仪上走一个荧光标记的高精度电泳，通过条带和分子量标准比较，判定分子量，并进行相关分析。 DNA测序应用 医学测序（基因突变、缺失等与疾病的关系等） 细菌、真菌鉴定（16SrRNA、D2rDNA测序） 杂合子、突变检测（SNP检测、微生物基因变异等） 基因进化分析（微生物溯源研究等） 长片段测序策略 随机法（或鸟枪测序法shotgun） 对靶DNA随机片段的亚克隆进行测序，利用