微生物检测-第五章 大肠菌群.pptVIP

卫生细菌学检验 第五章 大肠菌群的测定 一、定义及范围 大肠菌群（coliform group或coliform bacteria）: 在37℃能发酵乳糖，在24h内产酸产气的需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 包括大肠埃希菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属的一部分及沙门菌属的Ⅲ亚属（发酵乳糖）组成。 通常大肠埃希菌对靛基质(吲哚)、甲基红、V-P、枸椽酸盐利用四个生化反应分别为“++--”，称为典型大肠杆菌，其它类的称为非典型大肠杆菌。 二、测定的意义 1892年，沙尔丁格提出将大肠菌群作为水质粪便污染的指示菌（indicative bacteria） 成人粪便中大肠杆菌有108-109CFU/g。 适用于各种类型水的分析； 是存在于肠道中的特有菌； 当肠道病原体存在的同时大肠菌群也存在； 大肠菌群比最难对付的肠道病原体存活时间更长，对外环境的抵抗力大于等于致病菌； 进入水中不再繁殖； 检验方法具有很强的特异性和高度敏感性； 检验方法简便，易于操作、检出和计数； 对人类无害； 指示菌的水平与被粪便污染程度有某些直接的联系。 国际上如瑞士、瑞典等国以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌。 以100mL水检样内允许含有的大肠菌群的实际数值，以最大机率数（most probable number,MPN）来表示。 其它粪便污染指示菌 分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌 克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌 2. 不足之处 饮用水在含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行； 在一定条件下能在水中繁殖； 在外界环境中，有的沙门菌比大肠菌群更有耐受力。 3. 意义 控制肠道传染病的发生和流行 反映检样受粪便污染的程度 反映在生产各环节的卫生状况 具有广泛的卫生学意义 2.多管发酵法测定方法 发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无菌操作加水样100mL.在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样10mL,摇匀后，37 ℃培养24h。 平板分离：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝（紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯（玫瑰红色）琼脂平板上，35-37℃培养24h。 证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳糖发酵管中， 35-37 ℃培养24h，产酸产气，即证实有大肠菌群存在。 水源水 严重污染水：1，0.1,0.01,0.001mL 中度污染水：10，1，0.1,0.01mL 轻度污染水：100，10，1，0.1mL 大肠菌群变异不大的水源水：10mL10份 接种量1mL及1mL以内用单料乳糖胆盐发酵管，接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管中的总液体为单料培养液。 大肠菌群检索表（饮用水） 3.注意事项 乳糖发酵试验—分离培养—证实试验三步中，初发酵与证实试验可能相差较大。 抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大，胆盐剂量以0.5%较适宜。 挑选菌落时，EMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、粉色较低；无典型菌落时，宜多挑选。 有些在初发酵时产酸无气的，复发酵时却为阳性，用手轻拍管壁，观察有无气泡上浮。 1. 薄膜集菌法 薄膜集菌：取供试液333mL，以无菌薄膜过滤，将细菌截留在薄膜上。 培养检查：将上述集菌的薄膜面向上平贴在品红亚硫酸钠琼脂平板上，35-37℃培养24h，如有红色发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落，再做乳糖发酵试验。 发酵试验：接种于乳糖蛋白胨半固体培养基上，37℃ 6h-8h，产气者为阳性。 滤膜技术的优缺点 优点：重复性好，经常可能只需单一步骤，可在不同培养基之间进行转移，可处理大量水样，增加了分析的灵敏度，节省时间，较MPN法成本低。 缺点：高混浊度的水限制了取样的体积，背景细菌量较多，导致过度生长，金属和酚能够吸附到滤膜上，抑制了微生物生长。 2. Coli ID检测法 含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌（coliforms）群和鉴定大肠杆菌（Escherichia coli）,而不需附加任何试剂。抑制了革兰氏阳性菌和酵母菌，菌落颜色变化的敏感性完全适合食品微生物检验。红色菌落为大肠杆菌。蓝色菌落为其它大肠菌群。 3.TTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法 （1）TTC乳糖培养基制备 2%乳糖发酵管：乳糖、蛋白胨、水 TTC培养液：蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、十二烷基磺酸钠、水 以无菌操作进行分装。 （2）三料TTC乳糖培养基 接种：接种1、0.1、0.01mL各三管于中，若接种量为10mL，