高效液相色谱6.ppt

高效液相色谱技术与应用 （六）中性样品：反相与正相HPLC 本节主要内容 反相色谱 反相色谱的保留 反相色谱的选择性 色相色谱中非离子样品分离条件的优化 非水反相色谱 正相色谱 正相色谱的保留 正相色谱中非离子样品分离条件的优化 反相色谱（RPC） 反相色谱的保留 流动相的影响 流动相的影响 流动相的影响 反相色谱柱的选择性 RPC中用来改变中性样品选择性的主要参数有三个： 流动相组成 柱类型 柱温 溶剂强度的选择性 溶剂类型选择性 柱类型对选择性的影响 温度对选择性的影响 采用RPC分离中性化合物时，k值通常随柱温升高而降低。 反相色谱中非离子样品分离条件的优化 15或25cm、5μm　C8或C18柱为首选 以未经缓冲pH的CAN－水为流动相 流速1~2mL/min 柱温控制在35~45℃之间 最佳波长未知时，210nm可能是最佳首选 反相色谱中非离子样品分离条件的优化 优化选择性 混合有机溶剂的使用 混合有机溶剂的使用 柱类型与%B的影响 不同溶剂与柱类型的结合使用 不同溶剂与柱类型的结合使用 非水反相HPLC 非水反相色谱法（NARP）主要用于强疏水性样品的分离 流动相通常为高极性（A）和低极性（B）有机溶剂的混合。 一般A为ACN或MeOH，B为THF、氯仿、二氯甲烷、丙酮、甲基－叔－丁基醚或这些溶剂的混合液 改变%B与强溶剂的种类可控制样品的保留值 改变温度也可用于优化分离 非水反相HPLC 正相色谱NPC 固定相极性大于流动相，样品的保留值随流动相的极性降低而增加。 NPC可用于分离中性和离子样品，但以中性样品为主 正相色谱的保留 流动相的选择性 柱类型的影响 硅胶≈氧化铝＞＞氨基＞二醇基＞氰基 亲水样品的分离中水溶液流动相的应用 亲水作用色谱HILIC 正相色谱中非离子样品分离条件的优化 调整保留值 0.5＜k＜20 按照2倍步长降低%B：50%，25%，12%，6%，3%，以此类推。 优化选择性 采用水溶液流动相进行的NPC分离一般称之为亲水作用色谱（HILIC） * * 3倍规则（每降低10%B，k值增加大约三倍） % B的选择 流动相强度 RPC中溶剂强度顺序为：水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙醇＜二氯甲烷 流动相不含水的HPLC模式称为非水反相液相色谱（NARP） 色谱柱和柱温的影响 非极性、非离子化合物的RPC保留值：（弱）未键合硅胶＜＜氰基＜C1（TMS）＜C3＜C4＜苯基＜C8≈C18＜ 聚苯乙烯、多孔石墨碳柱（强） 对于非离子样品，通常柱温增加1℃，k值减少1~2% 三倍规则：%B增加两倍导致k值减小大约三倍 溶剂类型的应用在NPC和RPC中同样有效，采用三种B溶剂：非定位、碱性定位、非碱性定位，按适当的比例混合以控制选择性变化，使分离度变化加大 * * *