家蚕和野桑蚕解毒酶活性的比较及其野桑蚕CYP9A20V1基因的克隆和表达.pdfVIP

家蚕和野桑蚕解毒酶活性的比较及野桑蚕cYPgA20V1基因的克隆与表达 中文摘要 中文摘要中又摘要 昆虫体内有三大解毒酶系，分别为谷胱甘肽S．转移酶、酯酶、细胞色素P450 氧化酶，它们的功能主要是分解外源有毒有害物质，或通过与有毒有害物质相结 合，使得这些有毒物质无法到达作用靶标。野桑蚕和家蚕同属鳞翅目蚕蛾科，由 共同祖先进化来的，家蚕长期在室内人工饲养，而野桑蚕经过自然选择，其种群和 家蚕品种之间在抗性、遗传背景等方面都存在一定的差异。 为了了解家蚕和野桑蚕之间的三大解毒酶差异水平，采用酶活性动力学法测 定家蚕和野桑蚕5龄第3天幼虫不同组织的解毒酶活性。谷胱甘肽．S．转移酶在脂 肪体组织中的活性要高于中肠；家蚕脂肪体的GST活性为177．2+5．66 nmol／min／mg protein，野桑蚕的脂肪体GST活性为296士26．85nmol／min／mgprotein，是家蚕的1．67 倍，差异显著；而家蚕和野桑蚕中肠组织的GST活性差异不大。酯酶活性在组织 中以中肠活性最高，可以得知酯酶的水解作用主要发生在中肠中；家蚕中肠的酯 酶活性为235．8+3．28 nmol／min／mgprotein，野桑蚕中肠的酯酶活性为467．7+10．2 nmol／min／mgprotein，是家蚕的1．98倍，差异显著；而家蚕和野桑蚕脂肪体组织的 活性较低。野桑蚕的细胞色素P450氧化酶脂肪体活性高于中肠，而在家蚕中肠和 脂肪体中很难检测到活性。野桑蚕的三大解毒酶活性都要高于家蚕，与野桑蚕杀 虫剂抗性高于家蚕相一致。 昆虫解毒酶介导的抗药性主要有两种，一种是基因功能的改变，另一种是基 因的超量转录，导致了抗性的进化。有研究结果表明，一些昆虫对杀虫剂抗性的 增加是由于细胞色素P450氧化酶的改变造成的。比较和研究家蚕与野桑蚕细胞色 素P450基因的结构和功能，可从分子生化机制上研究家蚕对农药的抗性。 基于此，利用RT-PCR方法从野桑蚕中肠组织中克隆了一个P450家族基因 cYPgA20VI(GenBank登录号：FJ378716)。序列分析表明，该基因的开放阅读框 596 kD，等电点8．1。在 (ORF)为l bp，编码531个氨基酸，预测分子质量约61．4 家蚕和野桑蚕解毒酶活性的比较及野桑蚕cYPgA20vI基因的克隆与表达 中文摘要 的同源性分别是88．9％和94．1％，推测这2个基因具有相同的底物识别能力；野桑 分别为47．1％、88．2％、76．5％和60％，在底物识别区域的同源性较高。初步推测 野桑蚕CYP9A20V1基因可能与抗除虫菊酯类农药有关。 表达，并对其产物检测生物活性。构建一个Bac—CYP9A20V1重组病毒，用脂质体 法转染Sf9细胞，获得表达产物。SDS．PAGE和Western blotting分析显示，感染 重组杆状病毒Bac．CYP9A20Vl的细胞表达产物在约为64kD处出现特异性条带， 与推导的蛋白大小相符。该表达产物以PNA为底物测定酶活力，正常Sf9细胞和 活性为0．692±O．075nmol／min／mg 着较强的O．脱甲基活性，表达成功，为下一步研究其结构和功能打下基础。 关键词：家蚕；野桑蚕；杀虫剂抗性；解毒酶；CYP9A20V1基因；真核表达 作 者：徐生才 指导教师：沈卫德 ll 家蚕和野桑蚕解毒酶活性的比较及野桑蚕cYPgA20V]基因的克隆与表达 英文摘要 Cl ofdetoxification in 071 r