蛋白质沉淀技术精要.ppt

蛋白质沉淀技术 一、蛋白质的基本性质 蛋白质是人体机能构成成分,人体任何器官和组织都是以蛋白质作为重要组成成分。鉴于蛋白质重要性研究蛋白质分离十分必要。 1、胶体性质 蛋白质表面有一些亲水基团易起水合作用，从而形成水化层，导致蛋白质颗粒不易聚集沉淀，这些蛋白质分子直径在2～20nm范围，所以蛋白质溶液是亲水胶体，具有半通透性，丁达尔效应、布朗运动等一些亲水胶体性质① 。 2、两性解离和等电点 蛋白质可解离基团包括末端α-氨基和末端α-羧基及可解离侧链R基。这些可解离基团在特定的PH范围内解离，产生带正电荷或者带负电荷的基团。当溶液PH使蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质分子本身净电荷为零，此时PH即为该蛋白质分子等电点，用PI表示，测PI时一定在缓冲液中进行，因为离子强度可以使PI改变① 。 两性解离和等电点 3、沉淀作用 沉淀是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，形成固相从溶液中析出从而达到分离的一种技术。 沉淀分离方法和其他分离方法相比，优点是过程简单、成本低、原料易得，便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺点为过滤困难、产品质量较低，需重新精制。 4、变性作用 天然蛋白质受物理或化学因素影响，蛋白质分子内部维系其高级结构原有氢键、盐键等次级键遭到破坏，使分子内部结构发生改变，导致其生物学性质、物理化学性质改变，这种现象称为蛋白质变性作用。 5、凝固作用 变性蛋白质分子相互凝聚或相互穿插缠绕在一起的现象称为蛋白质凝固，例如生鸡蛋蛋白溶液受热变为蛋白块现象。 6、颜色反应 蛋白质颜色反应实际上是氨基酸一些基团肽键等与一定试剂所产生化学反应。 二、蛋白质沉淀分离技术 蛋白质胶粒上同性电荷互相排斥，不易凝聚成团下沉；蛋白质表面许多亲水基团水合作用形成一层水化膜,在胶粒之间起隔离作用，蛋白质在水溶液中,虽分子量很大,但仍能维持稳定溶解状态。若能除去其水化膜并中和其电荷,则蛋白质可从溶液中沉淀而出。常用有以下几种沉淀方法： 蛋白质沉淀分离常用方法 1、盐析法 2、有机溶剂沉淀法 3、等电点沉淀法 4、变性沉淀分离技术 5、复合盐沉淀法 1、盐析法（中性盐沉淀） 一般来说,所有固体溶质都可在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程称之盐析②。 （1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理 a.高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。 b.中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子。 盐析法 盐析机理示意图 盐析法 （2）中性盐的选择原则 a.要有较强的盐析效果。 一般来说，阴离子影响盐析的效果比阳离子显著，且含高价阳离子的无机盐比含低价阳离子的无机盐效果好。 b.要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响尽可能地小。 便于获得高浓度的盐溶液，尤其是在低温时，不至于造成盐结晶的析出。 c.不影响蛋白质等生物大分子的活性，并且，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。 d.来源丰富，价格低廉。 盐析法 常用的中性盐有：(NH4)2SO4 ，Na2SO4 ，NaH2PO4 等。其中最重要的是(NH4)2SO4。 优点：①溶解度大 ；尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 ②分离效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用，不易引起变性； ④价格便宜；废液可以肥田，不污染环境。 缺点：硫酸铵水解后变酸，在高pH值下会释放出氨，腐蚀性 较强，因此，盐析后要将硫酸铵从产品中除去。 盐析法 （3）影响盐析的因素 盐析法 c.pH值 盐析法 （4）脱盐 常用的脱盐处理方法有：透析法、超滤及凝胶过滤法。透析最早应用的膜分离技术。 2、有机溶剂沉淀法 （1）有机溶剂沉淀机理：降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,最后析出。 该法优点在于：a.分辨能力比盐析法高,即蛋白质只在一个较窄有机溶剂浓度下沉淀;b.沉淀不用脱盐，过滤较为容易。 其缺点是对具有生物活性大分子易引起变性失活,操作要求在低温下进行。 总体来说,有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍② 。 有机溶剂沉淀法 (2)有机沉淀剂 有机沉淀剂有乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、异丙酮等, 其中最常用的是乙醇和丙酮。蛋白质和酶的沉淀大多采用乙醇, 由于甲醇、丙酮均有一定毒性, 故使用时必须谨慎。 有机溶剂沉淀法 (3)有机沉淀剂分离技术的影响因素 有机溶剂沉淀法 (4) 应用实例 应用实例有高粱蛋白质的提取, 其基本工艺流程为: 高梁粉→萃取→离心→沉淀→水洗→烘干[4] 3、等电点沉淀法 （1）等电点沉淀法的原理 等电点沉淀法 （2）等电点沉淀法的影响因素 等电点沉淀法 (3) 应用实例 4、变性沉淀分离技术 （1）基本原理 变