STAT5b靶控报告基因检测胰岛素受体激酶活性细胞模型的建立.pdfVIP

Bulletin2009 ·267· 中国药理学通报ChinesePharmacologicalFeb；25(2)：267-9 戴清源L2，陈祥贵1，杨潇1，罗静1 (1．西华大学生物工程学院，四川成都610039；2．安徽工程科技学院生物化学工程系，安徽芜湖241000) 965．1 345．57；R394．2；R 中国图书分类号：R329．2；R 力，难以实现高通量的药物筛选。研究发现心]，转录激活因 transducerandactivatorof 5b1 文献标识码：A文章编号：1001—1978(2009)02—0267-03子STATSb(signal transcription 摘要：目的建立方便快捷的检测胰岛素受体激酶活性的方 法，为筛选抗糖尿病的药物提供一种新的细胞模型。方法 因检测IRTK提供了可能。 用克隆有胰岛素受体基因、STATSb基因和STATS响应元件本研究用分别携带胰岛素受体基因、STATSb基因和 靶控的荧光素酶报告基因的质粒共转染CHO细胞，RT-PCRSTATS响应元件靶控的荧光素酶报告基因的质粒共转染 检测外源基因的表达。转染的细胞经胰岛素处理，考察胰岛 CHO细胞，建立检测IRTK的新方法。 素对报告基因表达的剂量和时间效应，并采用AGl024处理1材料与方法 和肿lB基闪共转染考察模型的特异性。结果 经瞬时共 1．1材料CHO细胞株由plj川大学华西公共卫生学院提 供；连接了3个拷贝的STATS响应元件的TK启动子驱动的 转染的CHO细胞中检测到胰岛索受体和STATSb基因表达， 转染细胞中荧光素酶表达受胰岛素诱导且呈浓度依赖性和 时间依赖性，最高诱导表达率为6．25倍。胰岛素受体酪氨 David 酸激酶特异性抑制剂AGl024和酪氨酸磷酸化酶1BA教授惠赠；人胰岛素受体基因表达载体pRC／CMV· (m1B)可特异地阻断胰岛素的对荧光素酶表达的诱导效 应。结论该细胞模型通过报告基因表达检测胰岛素受体 叭l 激酶活性，灵敏性高、特异性强，在胰岛素受体激动剂和增敏 剂的筛选方面具有应用价值。 feetamine 自Sigma；TRIzol试剂购自GibcolBRL；反转录试剂盒、荧光 关键词：胰岛素受体激酶；STArlNb；报告基因；细胞模型 素酶检测试剂盒和半乳糖侍酶检测试剂盒购自Promega。 胰岛索抵抗是2型糖尿病发生、发展的关键因素，胰岛 1．2细胞转染和荧光素酶表达的检测CHO细胞于24孔 素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断是导致胰岛素抵抗 的直接原因。胰岛素结合并激活胰岛素受体酪氨酸激酶 hlR、pBS—SK-STATSb、pSV—p—Gal4种质粒以脂质体Lipo． (IRTK)活性是胰岛素信号通路的第一环节和关键步骤，因 fectamine TM2000按说明书进行共转染。转染细胞血清饥饿 此，增强IRTK活性理论上可克服或缓解2型糖尿病患者的24h后，换用含不同浓度胰岛索的培养基继续培养8h，或用 胰岛素信号通路障碍…。目前，IRTK已成为公认的抗糖尿 含10—tool·L“胰岛素的培养基继续培养不同时间，然后 病药物筛选靶点。但是，传统检测IRTK活性的方法费时费