生物化学和分子生物学技术(周俊宜)..pptVIP

脂质体法 重组体 脂质体 受体细胞 重组体克隆的筛选与鉴定 转化后的克隆群体： 1遗传检测法 1）抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 宿主细胞 ori 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 选择标记 ori 多克隆位点 转录终止区 RBS P O 表达型质粒载体图 ? 噬菌体载体 50kb ?+ LA RA LA RA EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ lacZ cI Am Neo P BamHⅠ HindⅢ ori BamHⅠ HindⅢ 限制性内切酶酶切 酶切 限制性内切核酸酶 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 酶切条件：酶切缓冲液 低盐组：0～50mmol/L NaCl 中盐组：50～100mmol/L NaCl 高盐组：100～150mmol/L NaCl 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 平端连接 AGCT TCGA AluⅠ DNA连接酶 AGCT AGCT TCGA TCGA 同聚物加尾连接 5’ 5’ 5’ 5’ AAA AAA TTT TTT TdT酶 连接酶 人工接头连接 BamHI BamHI BamHI 重组体的转化 受体细胞 重组体的转化 JM109感受态 含氨苄平板 Am 重组质粒 感受态 1原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型： 避免重组整合 转化亲和型： 较高的可转化性 遗传互补型： 利于筛选 感染缺陷型： 防止感染 2）转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG 介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 基因重组 转染 体外包装 噬菌体 噬菌体体外包装 3）转化率：转化细胞/细胞总数 影响因素： 载体：载体性质、空间结构、分子大小等 受体细胞 转化过程 2 真核细胞的转染 1）受体细胞系统 永生细胞系 细胞特异性的选择标记 对抗某种药物 磷酸钙介导的转染 重组体 + 磷酸钙微粒 内吞作用 重组体进入细胞 2）转化方法 大颗粒 * * 周俊宜 shying@gzsums.edu.cn 概 论 生物