库尔勒香梨茎尖果褪绿叶斑病毒原位RT-PCR检测技术研究.pdf

库尔勒香梨茎尖苹果褪绿叶斑病毒原位RT-PCR检测技术研究 硕士生： 刘宏 导师：牛建新教授 专业： 果树学 方向：生物技术 摘要 原位逆转录PCR是一种特异、敏感的分子生物学一细胞学方法，结合了PCR和原位杂交的优 点，既可检测出样品中低拷贝的核酸，又可确定其细胞来源和在细胞中的位置。开展该研究，可通 过观察扩增的eDNA在组织中的分布，进行病毒感染分析。这样既可为果树病毒检测提供一种新的 途径，又可为研究病毒在组织中的生成、分布和转移途径提供帮助，也为果树无毒化生产提供一理 论依据。因而具有重要的理论价值和生产实践意义。 增产物进行标记。研究了香梨茎尖石蜡切片IS-RT-PCR及原位杂交检测技术。 本研究的主要内容包括： 1．系统研究了石蜡切片方法对原位RT-PCR及原位杂交切片质量的影响。结果表明：组织经4％ 并用酒精．水浴法展片。适合于以茎尖为材料的原位RT-PCR及原位杂交。 2．用PCR法制作出了适合原位杂交的地高辛标记的cDNA探针。 3．应用了一步RT-PCR反应，简化了试验步骤，缩短了试验周期。 4．确定了梨树苹果褪绿叶斑病毒在茎尖中的分布位置。试验中设置了多种阴性对照，结果表现 为：阴性对照组织中均未显现蓝紫色。而阳性材料组织的一些细胞表现出明显的蓝紫色，说明梨树 苹果褪绿叶斑病毒在茎尖中有可能主要分布于幼叶的外围皮层组织及相应的初生维管柬。 此外进行了碱性磷酸酶显色系统可靠性研究，当切片仅在扩增时混合液中不加入地高辛标记的 核苷酸而其他处理相同，载片上的组织未显示蓝紫色，这说明结果不会受到内源碱性磷酸的影响， 具有较强的特异性。 关键词：原位RT-PCR，梨树，苹果褪绿叶斑病毒，地高辛标记，碱性磷酸酶显色 II in StudiesonIS-RT-PCRDetection ofACLSVKorla Technology Pear’SStem Tip PomologySpeciality Graduatestudent：Liu hong AcademicAdvisor：Professor NinJianxin DissertafionAbstract In is situlEverse chain situRT-IPCRla andsensitivemethod reaction(In rapid mmsciptepolymer,me for and in molecule wasacombinationofPCRand situ biology cytology，which examinlow nucleicacidsin couldstill theealluar and location copy tissue，yet identify origin ofsignals。 the has theoreticaland itwouldnot offerakindnew Domgstudyg