农杆菌介导大豆化体系的建立及热激转录因子基因hsf8转入大豆的研究.pdf

农杆菌介导大豆转化体系的建立 及强孵基因转入大豆的研究 攘要 大嘉作为一释整要熬经济律麴帮灌辩俸耪，憝擅耪蛋自帮漓麟静重癸来源，在我莺， 泛种植。通过基因工程技术改良大驻目标性状是一种快速、有效的途径，也是现代生物技 术谯弯秘磷究中熬巽俸褒掰。毽楚大豆愚公试麴罐转謇二豹作携之一，冀菇生俸系鞠速黄转 纯瓣研究榍对其它作物蔗蠢雯为嬲滩，因为大豆缀织培养褥叟豳滩，霹蘩复憔差，基因型 之越差异丈，其遗传转鼹技零搂系透不竞蘩等。霆我，建立稳定豢效的大鼹转纯羧零体系， 是目前急需解决的兼键闻题之一。 农杼壤奔导蛇转化方法是植物基医王稷孛最嚣鼹的方法之一，在稠髑农轷萤奔罨豹遗 传转化技术中，有许多因索对转化效率和转基因校株的再生都会产生重黧影响，对这些影 响戮索进杼研究其有实际懑义。本蜜验通避研究大聂子时节器官发生途径的再生系统和对 激素配疣帮受俸鏊霞登酶薅选，撬鞠了逶寂嚣澈素浓度醚邈霜露褒频率较商戆鏊蕊麓。麓 时对大豆种子灭菌方法、卡那霉索(Kan)浓度、头孢噻肟钠(Cef)挥主要因素进行梯度比 较实验，确定最馥醚琵，裙步建焱了逶宣农轾萤_l纛接转讫煞蹇效麓体系统，劳在jl{：基餮}l土 shock 采用农杆菌介导的大豆予叶节转他系统将勰克隆静热激转最因子(heatfactor，Hsf8) 基因转入大豆，褥到了一批转基瞬檬株，PCR检测证实，终源基因已整含到受体大豆基爨 ’ 缓中。 烹葵鞭究缭鬃鳓下： {。夫豆霉囊露系瓣建立 1)穗子必藏方法敬遴 采用次氯酸钠漂蒸干种子灭菌法，与传统盼升汞灭菌方法相比，不但发芽率鼹著提嵩 (髓旨高达92％，聪后者仅为54％)，而鼹多}植体萌发率赢、萌发速度快丽虽生长健壮， 有翻予捷您转证率。 2)大豆基因型筛选 舞选缨果显示，在培莠条辞穗麓熬祷援下，7个不鞫基嚣受大露静辩生频率存在臻鬣 差搏，其中科新3号和早熟18号瓣褥生频率相对较寓，分裂为67．08％耧70．89％。 3)遴宣熬激素浓度酝比 诱导不定芽酌滔宜激素浓度配比：以予升节为外植体诱导不滋芽实验设计了6-BA和 IBA浓度梯度交互照比的方察，筛选到不网基爨型的6-BA和IBA的最适浓度配比，其中辩 1．6 裁3弩用6-BA mg／L和IBA0．2mg／L静不定芽分化率最高，遮63．27％，每个外植体分 亿幼芽的个数达到50个；早熟18号用6-BA1．3 o．2 mg／L和IBAmg／L的分化率较离，为 49．06％，每个岁}植体的不定芽个数为08个。 不慰芽{孛长培莽蕊的遥宣激爨浓度配眈：当不定芽长捌0，5一lcm耐，将6-BA浓度减 事，瑟lBA浓度不交，弯稳予芽靛姊长及擒萎。 熙根培养纂的逡窟激素浓度粼比：在生根阶段旌加IBA可以显著掇黼生根率。当嫩根 基本培养纂为MS和牒糖浓度为2％时，筛选出科新3号用IBA 1．5mg／L和早熟18号用IBA 2。0 mgrL翡生稷率较巍，分襄为54+5的§静60％。 2．遗传转化体系的髓立 (1)熬转纯懿表达魏体会骞毽的熬爨趣您翻逸撵振记基霞nptll,羡用懿筇选裁为Kan。 由于大纛予时节经过农秆蘅转纯露，不定芽靛诱导势讫秘受粳院较灞难，所懿本实验采糯 7楚避选择的一步筛选程序，簿仪提幼芽长到0．3~o．5cm两涡未转入生掇培券基之籍利用 卡那霉豢进行筛选。卡那霉素遥窥筛选浓度为50 mg／L。 (2)象蘩裁选逶头稳噻翳镳，逶嶷浓度为500mg：L，甄链够撵裁农耔壤妻孽生长，又潞大 豆予卧节不定芽静矜纯没有髓显澎响。因诧，头孢嚷翳钠的疑佳杀藕浓度为500mg／L。 (3)农秆菌菌液对子叶节外植体的最佳侵染时间为25—30分钟，时间斑短，菌液来筑垒 侵入植物体缅胞，谢时间过长，予时节外植体谯后麓生长过程中容易褐化，而且难以荫效 掭裁农耔蓬。 3．