DNA重组克隆的单元操作课程.ppt

第二节 工具酶 一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease,RE） （1）限制（Restriction） （2）修饰（Modification） （二）限制性内切酶的类型 1. I型限制性内切酶 1. I型限制性内切酶 （3）切割位点 2. II类限制性内切酶 2. II类限制性内切酶 （3）切割位点 （4）粘性末端 ② 3’端凸出（如Pst I切点） 粘性末端的意义 ② 5’末端标记 （5） II 型限制性核酸内切酶的切割方式 （5） II 型限制性核酸内切酶的切割方式 （5） II 型限制性核酸内切酶的切割方式 3. III类限制性内切酶 （三）限制性内切酶的命名 （四）影响限制性内切酶活性的因素 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) 使用的时候要特别注意！ Eco R I 在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。 （五）限制性内切酶对DNA的消化 2. 完全消化 3. 局部消化 4. 限制酶酶切反应的终止 二、甲基化酶 三、 DNA连接酶(DNA ligase) 1、 定义 催化双链DNA片段靠在一起的 3`-OH末端和5`-P 末端形成3`,5`-磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。 小结 一、限制性核酸内切酶 二、甲基化酶 三、 DNA连接酶 四、基因工程中常用的DNA聚合酶： 1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 噬菌体DNA聚合酶 4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 耐热DNA聚合酶 6. 反转录酶 7.末端转移酶 五、T4多核苷酸激酶 六、碱性磷酸酶 七、核酸酶 ② 合成DNA探针 用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。 随机引物： 随机顺序形成的寡聚DNA片断。 （理论上它能与各种序列的模板结合） ③ RT-PCR用的模板 克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。 7. 末端转移酶 来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。 可在cDNA或载体的3’末端加同聚物尾巴，便于克隆。 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Mg2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAA OH3‘ p 5‘ TdT的基本特性： 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ TdT Co2+ dATP 5‘ p 3‘ HO AAAAAAAAAAAAAA OH 3‘ p 5‘ AAAAAAAAAAA 五、T4多核苷酸激酶 1. 来源 T4噬菌体的pseT基因编码。 从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。 多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。 2. 功能 催化?磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。 不论5’-OH端突出与否。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ ATP T4多核苷酸激酶 如果ATP的?磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。 但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。 3. 多核苷酸激酶的用途 DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。 5’ 3’ HO- -OH 5’ 3’ HO- -OH 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP 多核苷酸激酶 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 碱性磷酸酶 （1）正向反应（forward reaction） （2）交换反应标记法 反应混合物中具有超量(?-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(?-32P)ATP的?-32P与DNA5’端的磷酸交换。 3’ P- -OH 5’ 3’ HO- -P 5’ 3’ 32P- -OH 5’ 3’ HO- -32P 5’ (?-32P)ATP、ADP 多核苷酸激酶 反应效果不理想。 六、碱性磷酸酶 1. 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来。 Bacterial alkaline phosph