半乳糖-聚乙二-聚-L-赖氨酸质粒pEGFP-C1复合物纳米胶束的制备和性能研究.pdf

中文摘要 半乳糖一聚乙二醇一聚也一赖氨酸／质粒pEGFP．C1 复合物纳米胶束的制备和性能研究 中山大学附属第一医院 专业：生物医学工程 博士研究生：胡海梅 博士生导师：潘仕荣 教授 摘 要 肝脏是人体最大的消化腺，也是机体不可或缺的代谢中心，与人类许多遗传性 疾病、代谢性疾病、肿瘤密切相关。以肝癌为例，它对化疗和放疗均不敏感，能手 术根治仅占15％，其他的治疗效果也不理想。因此近几年随着分子生物学技术的 不断发展和人们对肝病发病机制的不断认识，人们将基因治疗引入各类肝病的治疗 中。基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治病目的的治 疗方法。在基因治疗中，体外DNA进入细胞的有效传递是极其关键的一步。目前 临床试验中所用的载体一般有两类：病毒载体和非病毒载体。为了避免病毒载体系 统可能引起的安全问题，非病毒载体系统传递DNA进入细胞是一种具有吸引力的 替代方法，从而对非病毒载体系统的研究也日益增加，例如阳离子脂质体／DNA复 合物和聚合物／DNA复合物。脂质体、聚阳离子作为非病毒载体，由于具有安全性 和价格低廉的优点，近十年来已被广泛的研究。尽管有报道脂质体基因载体在体外 有较高的转染率，但一些脂质体基因载体在水溶液中不稳定，在血中聚集。聚阳离 子包括聚赖氨酸(PLL)和聚乙烯亚胺(PEI)，二者能浓缩质粒DNA而免遭酶的降解， 从而增强了转染率。然而，这仍然存在着一些缺点，例如在体内的生物相容性。为 克服这些生物相容性问题，无毒性可生物降解的聚合物基因载体作为有前景的基因 中文摘要 传递材料已发展起来。为增强基因传递至特异性细胞，聚合物基因载体用部分靶向 专属性的配基来修饰，例如半乳糖，转铁蛋白和各类抗体。因此，基因治疗成功的 关键是如何有效地将基因释放到靶细胞而又较少地产生副作用，即载体效率、靶向 性和安全性的问题。而肝脏以其独特的结构和复杂的功能已成为人类疾病基因治疗 最主要的靶器官，将外源基因导入肝细胞以调控其功能产物的合成与分泌，可有效 治疗肝脏疾病。 在各种阳离子聚合物中，PLL已经广泛地用于基因载体，因为它有极好的浓缩 DNA能力，然而，PLL在体内和体外的细胞毒性作用和相对低的转染效果，PLL 本身并不是一种理想的转染载体，为增加血浆蛋白表面的转染率，将PLL用亲水性 和生物相容性的PEG修饰，结合形成接枝或嵌段的共聚物结构。为增加组织特异 性，将PLL以具有靶向性的配基柬修饰。用PEG修饰PLL／DNA复合物，表明降 低了血浆蛋白的相互作用，减少了细胞毒性，相应增加了转染率。裸露的PEG段 表面的空问结构效果，减少了非特异性蛋白吸收进入刚离子聚合物／DNA复合物， 使其进入细胞，促进细胞摄取。 本研究正是鉴于上述考虑，设计了一种嵌段共聚物，其亲水段为在人体内不会 产生毒、副作用，乇免疫源性的聚乙二醇，而疏水段则为聚，￡．赖氨酸，因此利用两 组分形成的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物降解性。为增强对细胞的靶向 性，将半乳糖与嵌段共聚物相连制成具有受体介导的靶向基因给药载体 壳纳米胶束)。该共聚物连有靶向性的配基一半乳糖，这种乳糖化的PEG—PLL／ pEGFP．CI复合物可以特异性的将pEGFP．C1投向于肝细胞，具有相对较高的基因 转染率，可生物降解性，低毒性和好的抗免疫原性。因此咀绿色荧光蛋A (pEGFP—CI)为报告基因，构建载体基因药物治疗模型，并研究该系统在肝细胞 的靶向效果，从而寻找--：fO高肝靶向型的基因载体系统，为肝病的靶向基因治疗提 供理论依据和实验基础，同时为今后共聚物自组装体系，聚阳离子非病毒型基因载 体、基因治疗等领域的研究和发展提供科学依据。围绕上述研究目的，本文主要探 讨了以下几方面的内容。 (1)聚也．赖氨酸的合成与表征 以￡．赖氨酸为原料，先制备Ⅳ‘．苄氧羰基上．赖氨酸，光气法合成_Ⅳ‘-苄氧羰基 中文摘要 ．￡．赖氢酸．Ⅳ_羧酸酐，并以三乙胺为引发剂，在氯仿中引发聚合，生成聚(Ⅳ‘-苄氧 羰基赖氨酸1，经无水溴化氢脱苄得