《组织工程期末复习资料（完整）》.docVIP

组织工程 1、组织工程：将细胞① 、合成材料及处理过的天然材料 组成要素/原理：组织工程依赖于细胞、支架材料和调节因子是否能有机结合。 ①种子细胞 ②生物支架材料 ③细胞与材料的应力场三维培养 ④体内植入研究 ⑤检测方法及检验标准 ⑥临床验证研究 ⑦产业化研究 3、种子细胞的选择应满足的要求 ①采用非侵袭或微创手段即可获得 ②分裂增殖能力强、功能旺盛 ③无或仅有极微弱免疫排斥反应 ④能连续传代，并且传代培养后不发生形态、功能及遗传物质的改变。 4、弹性模量：固体材料为抵抗外力产生拉伸或压缩弹性变形的能力，是材料原料问题在工程技术中常用的参数。 5、二倍体细胞培养法：即始终维持培养的细胞染色体倍数为二倍体的方法。 6、二倍体细胞培养的主要原则 ⑴稳定培养条件 ①营养条件 选用高质量培养基和血清，营养条件建立后宜保持不变。 换液时间间隔勿太长，半量更换，以利细胞对换液的适应。 ②酸碱度：尽量减少变化。 ⑵减少传代次数 ①选择合理的接种密度。 ②细胞接种数量、培养条件（培养液量、培养空间）一样。 ⑶冷冻保存 ①保种：原代或传代培养前几代的二倍体细胞。 ②复苏：细胞复苏后再传代1-3次，使细胞生长稳定，然后一部分用于实验，一部分用于冷冻保存。 7、上皮组织细胞体外生长的特殊条件 ①防范微生物污染 生长基质的支持 特殊培养基 去除成纤维细胞 （气-液界面培养法：培养技术的方向 ①采用真皮或真皮样底物培养，并制备成复合皮片或双层皮肤类似物。 ②将复合皮片进行气-液界面培养，即将角质形成细胞层暴露于空气中，促使细胞分化。） ⑴在人去表皮真皮上培养角质形成细胞 ①人去表皮真皮（无细胞真皮）的制备 ②真、表皮组织的分离（酒精浸泡除脂肪、结缔组织——中性蛋白酶消化） ③角质形成细胞的分离培养（胰蛋白酶+EDTA） ④复合培养法 ⑵在人工真皮上培养角质形成细胞 ①胶原网架的制备 ②真、表皮组织的分离 ③表皮角质形成细胞的分离 ④真皮成纤维细胞的分离培养（胶原酶消化） ⑤接种角质形成细胞 ⑥气—液界面培养 9、成骨细胞培养 ⑴骨内成骨细胞的培养 ·方法：①植块培养法（细胞移行生长法）②分离细胞培养法 ·体外培养的成骨细胞依次进入： ①增殖期：Ⅰ型胶原开始表达 ②基质合成期：Ⅰ型胶原达高峰；ALP出现——成骨细胞分化的早期标志 ③钙化期：ALP达高峰；OC表达——成骨细胞分化成熟的标志，钙结节成熟后达高峰。 ·培养成骨细胞的鉴定 主要指标：Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶骨钙素OC 体外培养的成骨细胞融合后，胞质内ALP 组织化学钙-ALP染色，呈阳性反应。 ②骨钙素免疫组织化学染色 　用抗-骨钙素特异性抗体进行免疫组化染色，成骨细胞胞质呈阳性反应。 ⑵骨膜内成骨细胞培养 10、软骨细胞的培养 ·培养方法：取材—机械分离—酶分离—离心收集细胞，PBS洗涤，过滤，计数，接种 ·软骨细胞的反分化现象： ①形态：单层培养传代后，失去原有形态，出现成纤维细胞样变。 ②功能：PGs合成、分泌减少，硫酸化程度降低；标记性蛋白 ·细胞鉴定： 软骨细胞的特征性分泌产物： ①Ⅱ型胶原检测：用其抗体作免疫细胞化学染色 ②酸性糖胺多糖检测—甲苯胺蓝染色：若细胞外基质中存在酸性糖胺多糖，则呈异染性（红色）。 ⑴大鼠小脑皮质神经元的体外培养 ·培养方法：细胞悬液的制备——生长基质盖片的制作——接种培养 加入抗有丝分裂剂：抑制非神经元细胞增生（DNA合成抑制剂） 神经元细胞的体外培养只是短期培养。 ·影响神经元体外培养存活率的因素： ①取材动物年龄：出生后6天内大鼠。 ②接种密度：2-4×104个／cm2存活率较高。 ③培养：对谷氨酸毒性敏感，使用条件培养液。 ④减少体外处理神经元的时间和步骤。 ·神经元类型的鉴别方法：逆行示踪法、免疫细胞化学法、电子显微镜观察、电生理检测（根据动作电位的特征来鉴定兴奋性或抑制性神经元） ⑵大鼠星形胶质细胞的体外培养 ·原代培养：取材—分离—初细胞悬液—孵育—次细胞悬液—混合细胞培养物 ·神经胶质细胞的分离和纯化: ①分离原理 a.星形胶质细胞增殖速度大于其他神经细胞 b.星形胶质细胞与其他胶质细胞分层生长，星形胶质细胞在底层 c.振荡法：分层生长的细胞以一定力度摇动，可选择性脱壁 ②胶质细胞分离、纯化流程 ·污染细胞的去除： ①成纤维细胞（主要污染细胞） 原因——取材时脑膜未去干净 消除方法：提高接种密度；D-缬氨酸取代培养基中L-缬氨酸 （FB缺乏D-缬氨酸氧化酶，无法利用D-缬氨酸合成L－缬氨酸） ②神经元的污染：神经元细胞对谷氨酸浓度敏感，培养液中15μmol/L谷氨酸的浓度足以对神经元产生毒性作用；神经元对机械干扰敏感，经过振荡将失去活力 1)常规分离细胞培养法 ·培养方法：取材—机械分离与酶分离—制备细