现代分子生物学技术在病理生理学中的运用.ppt

1953年：Watson和Crick发现DNA双螺旋结构，获 1962年诺贝尔奖。 60年代中期：确定遗传信息传递的中心法则： DNA→RNA→蛋白质 1967年：破译全部遗传密码（三联密码），获1968 年诺贝尔奖。 1968年：发现限制性核酸内切酶获1978年诺贝尔奖。 1972年：产生第一个重组DNA分子。 1982年：建立第一个转基因动物模型。 1990年：首例基因治疗。 1990年：启动人类基因组计划。 2003年: 基本完成人类所有基因的全序列测定,后基因组时代开启。 2 操作过程 SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 二、大鼠心肌缺血预适应延迟相的蛋白  质组学分析 1）已知蛋白之间相互作用的检测： 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸； 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。 2 免疫共沉淀 （1）原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用 单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术 宿主细胞: 杂交瘤 细菌 筛选范围 : ~103 107?109 时间: 几个月 几周 操作: 繁杂 相对简单 免疫: 必须 可避免 人源抗体: ? + 费用: 高 低 生产量: 有限 无限 基因获取: 再克隆 直接 应用前景: 有限 不可估 噬菌体cDNA展示技术的应用 1 用于模拟表位的研究。 2 用于DNA、RNA结合蛋白的研究。 3 用于蛋白-蛋白相互作用的研究。 4 用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。 5 细胞与蛋白相互作用的研究。 6 酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。 CuZn-SOD转基因小鼠（Deshmuckh, 1997） Mn-SOD转基因小鼠（Chen, 1998） 细胞外SOD转基因小鼠（Chen, 1998） 过氧化氢酶转基因小鼠（Li, 1997） GSH-Px转基因小鼠（Yoshida, 1996） 金属硫蛋白转基因小鼠（Kang, 1999） HSP70转基因小鼠（Marber, 1995） HSP70转基因大鼠（Hutter, 1996） GSH-Px基因敲除小鼠（Maulik, 1998） 诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）基因敲除小鼠（Xi, 1999） 2 . 败血症休克 脂多糖结合蛋白(LBP)敲除 (Jack RS, 1997) 清道夫受体敲除 (Suzuki H, 1997) CD14受体敲除 (Haziot A, 1998)