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罗非鱼无乳链球菌病的病理症状 疫苗研究状况 关于罗非鱼无乳链球菌疫苗的研究，国外已开展该病灭活疫苗的研究和探索，并取得一定成效；但国内仍处于实验室研究阶段。 研究目的与意义 通过制备疫苗来预防罗非鱼链球菌病的爆发，为罗非鱼链球菌病的预防和防治提供科学的理论依据。 2.病原菌的分离、鉴定及致病性分析 实验结果 1.细菌分离培养结果显示：在BHI固体培养基上28 ℃培养24h，病鱼的脑、肝、脾、肾等组织分离的菌落形态均一、大小与颜色相近，菌落呈透明、湿润、圆形、边缘整齐等；在血平板上呈β溶血；革兰氏染色结果显示菌体为链状或成对排列的革兰氏阳性球菌。 图2 分离菌株的16SrRNA基因的PCR扩增结果注：M：DNA标记；1-9：分离菌株 2. 16S rRNA鉴定结果：分离菌株经细菌16S rRNA 基因通用引物fD/ rD扩增后得到1.5 kb 大小的片段（图2表示部分菌株的PCR结果），结果与预期目标相符。通过基因测序可得出分离菌与无乳链球菌NCBI所对应的16S rRNA基因序列比对在99%以上，因此可确定分离株为无乳链球菌。 实验结果 3.致病性分析：分离菌株对罗非鱼的半数致死量测定如下表所示 3.无乳链球菌培养基及培养条件的优化 实验主要探讨脑心浸液（BHI）液体培养基的营养因子、初始pH 值、溶氧、温度等因素对无乳链球菌生长的影响，并采用正交实验法对无乳链球菌培养基营养因子添加量进行优化，以寻求无乳链球菌培养的最佳参数，为鱼类无乳链球菌疫苗的研制提供基础资料。 实验结果 1.温度对无乳链球菌生长的影响 2.初始pH值对无乳链球菌生长的影响 3.振荡培养对无乳链球菌生长的影响 4.葡萄糖和酵母粉对无乳链球菌生长的影响 无乳链球菌在优化条件下的生长动态 4.无乳链球菌灭活疫苗的制备 实验结果 1.菌株灭活条件筛选结果 无乳链球菌在加入含有0.4%福尔马林的BHI液体培养基中28℃振荡灭活48h效果最佳。 2.疫苗的质量与安全性检测结果 （1）无菌检测 （2）均匀度检测 （3）安全性检测 5.无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫功能的影响 疫苗免疫方式 （1）注射组选用的疫苗是无乳链球菌白油佐剂灭活疫苗，实验分为5组： （2）浸泡组选用的疫苗是无乳链球菌水剂疫苗+佐剂 1.注射组血清抗体效价检测结果 2.注射组非特异性免疫指标检测结果 （1）血清溶菌酶活力检测结果 （2）血清超氧化物歧化酶活力检测结果 （3）血清过氧化氢酶活力检测结果 （4）血清丙二醛含量检测结果 3.浸泡组血清抗体效价检测结果 4.浸泡组非特异性免疫指标检测结果 （1）血清溶菌酶活力检测结果 （2）血清超氧化物歧化酶活力检测结果 （3）血清过氧化氢酶活力检测结果 （4）血清丙二醛含量检测结果 5.疫苗对罗非鱼的免疫保护率结果 （1）注射组 （2）浸泡组 总结 1.实验于2011年在华南不同罗非鱼主养区患病的罗非鱼中分离到40株链球菌，通过16SrRNA方法鉴定为无乳链球菌，并对不同地区的菌株进行了攻毒实验，结果显示湛江的临床分离株对罗非鱼的致病力比其它地区的菌株强。 2.实验确立了无乳链球菌培养条件中生长的最适初始pH为7～8，培养温度为28～37℃，振荡转速为180～200rpm，在BHI培养基中添加2 mg/mL的葡萄糖和20 mg/mL的酵母粉即可在对数期获得最大细菌量。 3.实验结果表明无乳链球菌灭活疫苗通过注射和浸泡接种罗非鱼，结果显示注射组的最高相对保护率为95%，浸泡组的最高相对保护率为64%，两种疫苗对罗非鱼链球菌病均有较强的免疫保护力，免疫佐剂对浸泡免疫可获得较好的免疫保护效果。 致谢 感谢我的导师简纪常教授、吴灶和教授和鲁义善教授，他们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；值此论文完成之际，谨向三位老师表示深切的敬意和衷心的感谢！ 感谢王蓓老师和黄郁葱老师在学习和生活上给予我的关心，以及在我试验有困难时给予耐心的解答与帮助，同时也要感谢实验室所有老师的关心和帮助。 感谢实验室各位同窗好友、师兄师姐和师弟师妹在实验中给予的帮助，以及对我所遇到的问题给予耐心的解答。 感谢我的家人尤其是我的父母对我的无私奉献、关爱和理解。 最后向所有关心和帮助过我的人表示真心的感谢。 a，b，c，d分别表示疫苗浓度为5.0×108、1.0×109、2.0×109 和4.0×109 cfu/mL的注射免疫组，e为对照组 a，b，c，d分别表示疫苗浓度为5.0×108、1.0×109、2.0×109 和4.0×109 cfu/mL的注射免疫组，e为对照组 a为对照组，b，c，d，e分别表示疫苗浓度为5.0×108、1.0×109、2.0×109 和4.0×109 cfu/mL的注射免疫组 a，