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SARS-3CL蛋白酶在杆状病毒系统表达的研究 Studies ofSARS-3CLProteinase onthe Expression in Baculovirus System Expression 摘要 vector 【目的】昆虫秆状病毒表达载体系统Coaculovir．s system， expression 状病毒编码的一种蛋白水解酶，在SARS冠状病毒的复制中起着重要作用．本实 验旨在用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，构建3d基因的重组表达载体，并 制剂奠定基础。 【方法】月j酶切连接方法将3“基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTB中， 构建成重组转座载体pFB E．coli感受态细胞，两次蓝白斑初步筛选阳性克隆，双重PCR再次鉴定，抽提大 分子质粒DNA并纯化，获得含SAILS．3CL蛋白酶基因的重组杆状病毒穿梭载体 状病毒颗粒，感染St9细胞，上清中病毒用PCR鉴定，收集的蛋白进行SDS-聚 为进一步筛选SARS-3CL蛋白酶的抑制剂奠定工作基础。 【结果】利用连接酶成功构建了pFBHTB-3CL重组体，经测序证明插入序列完 全正确，重组体经转化DHl0Bac -3CL，蓝白斑筛选到白色克隆为阳性克隆，经双重PCR鉴定证明3CL蛋白酶基 因成功转座到杆状病毒载体上，脂质体介导转染Si9昆虫细胞，细胞发生明显病 变。得到大量的病毒，再次感染后，上清中病毒进行PCR鉴定正确，但提蛋白 进行SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳及WesternBlot检涌，没有得到预期的蛋白条带。 HTB-3CL重组体，重组体转化DHl0BacE．coli感受 【结论】成功构建了pFB 态细胞，3CL蛋白酶基因成功转座到杆状病毒载体上，脂质体介导的转染效果 明显，但蛋白的检测效果不明显，实验条件有待进一步探讨，以最终得到3CL 蛋白酶。 【关键词】SARS．3CL蛋白酶；昆虫杆状病毒表达系统；Si9昆虫细胞；转移 E．coli：Bacmid；双酶切；测序；转座 载体；穿梭载体；DHl0Bac Abstract vector is ofthefour 011e system [objective]Baculovirusexpression expression in realm．SAR$一3CLisa systemsgeneticengineering proteinaseproteolyticcnzyme encodedSARS is intheSARSCoronavirl培’s Coronavirus，it by veryimportant aim this touse of is Bac-to-BacBaculovirus duplication．Thestudy Expression toconsturct System 3d雕tccombinmtexpressionvector,