细菌的生化鉴定.docVIP

试验三 细菌的生化鉴定 试验目的：掌握常用细菌生化鉴定方法和结果判定 熟悉细菌生化反应的临床意义， 试验仪器：电热恒温培养箱、电冰箱、蒸汽高压灭菌器、超净工作台、电子天平、普通光学显微镜、鼓风电干燥箱、电磁炉、微波炉、生物安全柜等 试验材料：菌种：大肠埃希菌 培养基：EMB、KIA、葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖 试剂：革兰染液 试验步骤： 1、分离培养：EMB平板制备，并分离划线； 2、形态学观察： ①菌落形态观察;观察比较三种细菌在EMB琼脂培养基上的菌落有何区别，并加以描述。 ②菌体形态观察；革兰染色，将三种细菌涂在一张载玻片上，镜下观察细菌形态 3、生化鉴定：穿刺接种五糖管、双糖铁 4、血清学鉴定：伤寒沙门菌、志贺菌 5、结果报告 ①菌落形态特征描述； ②菌体镜下形态画图 ③生化鉴定结果；以列表形式给出，KIA用 -/-或+/-或-/+表示 ④血清学鉴定结果 6、讨论：针对试验出现问题加以讨论。 讲解： 细菌鉴定的基本步骤： ①分离培养观察菌落形态特征：大小、湿润度、边缘、特征等。 ②革兰染色：观察镜下菌体形态特征及染色性。 ③生化鉴定：不同系均具有各自独立的酶系统，因而对底物的分解力各不相同，其代谢的产物也各异。这些代谢产物又个具有不同的生物化学特征，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种的鉴定无论是应用手工鉴定还是自动化仪器鉴定，都需要通过这些生物化学试验来实现，可见掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。因此依托前两项（特性观察和染色性）的结果，选择特征性的生化试验，是细菌鉴定的必要步骤。 ④血清学鉴定：在以上结果符合所检定的目的菌时，选择相应的鉴定血清做进一步鉴定菌种。 培养基成分及原理、接种方法及用途： ① 伊红---美兰培养基（EMB）：该培基中含有4%伊红和6.5%美兰两种指示剂及0.5%的乳糖和0.5%蔗糖，若被检菌能分解乳糖产酸，使培基的pH下降，则促使伊红与美兰结合成紫红色或紫黑色复合物，并附着于菌落的表面，且使菌落表面带有金属光泽；而碱性环境中二者不结合。故不分解乳糖的细菌其菌落无色。 伊红---美兰有抑制G+生长的作用，但粪链球菌除外。 该培养基亦是肠道菌的鉴别培养基。 接种方法：四区划线 ② 双糖铁培养基原理：该培养基中加的葡萄糖的乳糖。细菌分解糖类产酸指示剂可使培养基。，产生少的酸又在有O2的情况下氧化，失去改变局部酸碱度的作用，所以培养基斜面部分在高层中生长细菌，因处于无O2状态，产生的酸不分解，故使高层部分培养基。H2S，H2S+ Fe2+反应生成FeS使培养基变黑。硫代硫酸钠是一种还原剂，防止培养基中氧化物与H2S作用而影响FeS的生成。由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，