实验二土壤中放线菌的分离.docVIP

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。 放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。掌握法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。掌握从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 ?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-浓度的土壤稀释液。依此类推，直稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释倒平板法取套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别姓名、操作日期等。每个稀释度做个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀法 将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液（5）接种完毕，将平皿放入28恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌菌落 2.观察与记录以下内容。 大小 形状 边缘颜色 表面代谢物 种类 3.如何区分放线菌和真菌、细菌？ 放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟放线菌都差不多，比如都是颜色多种多样，与培养基紧密结合难于挑取。但在气味上有很大差别，放线菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。稀释平板的稀释度不够，放线菌抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。