《分子生物学北京培训内部讲义》.docVIP

第一部分 DNA重组技术 实验一 聚合酶链反应 【实验目的】 掌握基本PCR扩增方法及PCR反应条件优化。 【实验原理】 用PCR方法进行的基因扩增过程类似于体内DNA的复制过程。主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的过程，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸三个步骤组成的不断重复的过程。每次重复的三个步骤称为一个周期，经过25～30个周期之后，PCR产物以指数方式增加可达106 ～107。目前，人们已根据各种用途设计了不同的特殊PCR，本实验介绍的是经典PCR技术。 【实验材料】 （一 ）模板DNA： 模板可以是单链或双链；可以是染色体DNA；亦可以是克隆的质粒DNA。本实验使用克隆的质粒p-FHL2 (1μg/μl)经100倍稀释作为模板。 表 PCR反应体系模板量 以50ul PCR 反应体系为例 人基因组DNA 0.1～1μg 大肠杆菌基因组DNA 10～100ng 质粒DNA 0.1～10ng λDNA 0.5～5ng （二 ）2×Taq PCR MasterMix: 0.1 U Taq Polymerase/μl，500 μM dNTP each，20 mM Tris-HCl (pH8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl2，其它稳定剂和增强剂，使用终浓度为1×PCR buffer。适用于常规PCR反应、复杂模板如GC含量高（60%），有二级结构等的扩增和大规模基因检测。 （三 ）引物： PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。 1. 引物序列：本实验PCR 扩增片段大小约851bp。 P1（FHL2-1）：5- gga tcc gt atg act gag cgc ttt gac tg -3 P2（FHL2-2）：5- gcg gcc gc tca gat gtc ttt ccc aca gtc -3 2. 引物的浓度 公司合成的引物通常为干粉，使用前应先离心，然后再打开管盖溶解。通常配成贮存液浓度100pmol/ul，-20℃保存使用浓度10pmol/ul使用终浓度0.4pmol/ul。 3. 引物稀释计算示例： 例一： ⑴假设引物合成量为1 OD，配成贮存液浓度100pmol/L ；引物长度20nt ；A/G/C/T平均分子量为324；因此，总分子量：20×324=6480 ⑵1OD260=33ug，引物浓度为 33ug/6480=0.0050925 um=5.0925nm =5092.5pm ⑶引物稀释：5092.5pm/100p=50.9ul，即用50.9ul去离子水溶解，贮存浓度为 100pmol/ul。 例二：直接法计算贮存浓度为100pmol/ul。 预稀释引物的微升数（ul）= OD数×33×10000 引物分子量 【实验反应条件设置】 1．循环温度及参数设置 典型的PCR循环由三部分组成： ① 模板热变性 ② 退火 ③ 寡核苷酸延伸 ⑴ 变性温度与时间: ① 由G+C含量决定；② 由DNA分子长度 ⑵ 退火温度与时间: 取决于引物的长度、浓度和G+C含量。引物长度为15～25时，退火温度可选用Tm -5℃，时间30sec。 ⑶ 延伸温度与时间: 72℃ 10min。 ⑷ 循环数一般以20～30次为宜。 【实验器材】 0.2ml PCR管 0.5离心管 2400/ 9700 PCR扩增仪 冰盒 台式离心机 水平式凝胶电泳设备 【实验步骤】 配制PCR反应体系 1．按μl PCR反应体积配制反应混合液，用0.2ul PCR反应专用薄壁管，按下列程序依次加入试剂(装有2×Taq PCR MasterMix的管为反应管)，注意：模板DNA最后加，防止污染。成分加量（ul） 终浓度 模板 1 0.1～10ng 1（上游引物） 1 0.4pmol/L 2（下游引物） 1 0.4pmol/L 2×Taq PCR MasterMix 12.5 1×Taq PCR MasterMix H2O 9.5 补水至 ul 总体积 25 ul 二、PCR反应条件 2．将上述液体混合，短暂离心以集中液体，置PCR仪依下述条件进行反应。PCR反应 预变性 变性 退火 延伸 总延伸 循环周期 1 94℃ 5min