PCR和qPCR.ppt

- PCR 产物确认 - PCR 产物区分 - SNP 检测 - 突变检测 - 甲基化分析 溶解曲线分析 溶解曲线 高分辨率溶解曲线 溶解曲线分析 消除非特异性产物的干扰 通过融解曲线确定非特异产物和目的产物各自的Tm 如果目的产物的融解温度高于非特异性产物的，且差异明显则可通过调整读板温度来消除干扰信号 什么是高分辨率溶解曲线（HRM）? - High Resolution Melt 高分辨率溶解曲线和普通溶解曲线不同，采用双链高饱和荧光染料来标记，能精确区分出单个SNP。 染料激发波长：440-470；发射波长：470-520 HRM对荧光定量PCR仪的要求 - 并不是所有荧光定量PCR仪都能做HRM - 精确的温度控制（高均一性，升温速率可精确调节） - 探测器读板速度快 每升温1度，读板10-25 次 - 软件有温度校正和信号校正功能 溶解曲线分析 SNP分析 ---- 高分辨率溶解曲线 医学应用 无需探针设计 Thermo Fisher ScientificPikoREAL 荧光定量PCR仪 目录 荧光定量PCR仪硬件组成分析 四类关键部件： 光源 热循环仪模块 光路系统（滤光片，二分镜，反射镜等） 荧光信号探测器 主要关注点: 能同时扩增的样品数 能同时探测的荧光染料种类 2 1 3 4 荧光定量PCR仪硬件组成分析 各品牌荧光定量PCR仪光源列表 LEDs Tungsten Lamp Laser Xenon Lamp Qiagen RotorGene Q Agilent MX3005P Life Tech 7900 HT Roche LightCycler 480 Cepheid SmartCycler Life Tech 7500 Fluidigm BioMark Bio-Rad MiniOpticon Life Tech 7300 Bio-Rad CFX Bio-Rad MyIQ2 Life Tech StepOne Bioneer ExiCycler 96 Life Tech StepOne Plus Life Tech OpenArray Roche LightCycler 2 Eppendorf ep RealPlex Esco Swift Illumina Eco Thermo PikoREAL 各品牌荧光定量PCR仪热循环仪模块列表 Peltier Block Individual Peltier Heated Air Specialized Consumable Life Tech StepOne Cepheid SmartCycler Qiagen RotorGene Q Life Tech 7900 HT Life Tech StepOne Plus Roche LightCycler 2 Fluidigm BioMark Life Tech 7900 HT Life Tech OpenArray Life Tech 7500 Life Tech 7300 Bio-Rad MiniOpticon Eppendorf ep RealPlex Esco Swift Agilent MX3005P Roche LightCycler 480 Bioneer ExiCycler 96 Bio-Rad MyIQ2 Bio-Rad CFX Illumina Eco Thermo PikoREAL 目录 PikoReal 实时荧光定量PCR仪 光源 荧光定量PCR —— 基本原理 热循环仪 探测器 可以实时检测出每轮循环的PCR产物量，作出反应曲线，通过换算直接得出初始样品量 加入荧光染料的PCR体系 模板，引物,dNTP, 缓冲液,DNA聚合酶和荧光探针或荧光染料 在体系中原料充足的情况下，产物按固定倍数呈指数增长 指数增长期间，初始模板浓度不同的样品的扩增曲线彼此平行 不同浓度（依次10倍稀释）的同一样品的扩增曲线 扩增曲线循环数与初始模板浓度的对数值成线性关系 Ct 荧光定量PCR —— 基本原理 未知浓度样品 荧光定量PCR —— 荧光染料和探针 非特异性的荧光染料 SYBR Green I ResoLight dye（HRM） 特异性的荧光探针 TaqMan Molecular Beacon 等 SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission 非特异性荧光染料 – SYBR- Green SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 非特异性荧光染料 – SYBR- Green 融解曲线分析（Tm） 非特异性荧光染料