《Real-Time PCR 原理及應用》.pdfVIP

Real-Time PCR 原理及應用 研究部 黃欣儀 Real-Time PCR 基本原理： PCR反應循環逐次增加時，目標 DNA也隨之快速增幅，此時 PCR反應液反應中之特定的螢光物質可與目標 DNA結合而產生螢 光，經由儀器偵測後即時將訊號資料呈現並計算。 基本原理： 目標 DNA起始的量愈多，其螢光值愈早達到偵測之閥值 (Threshold) ，此時所對應的循環數(cycle)稱之為 Ct值。因此，目 標DNA的濃度與 Ct值成反比關係。 依據連續稀釋標準樣品的 Ct值及已知濃度，可得標準曲線，根據 此標準曲線可以推算樣品的起始濃度，達到定量測試之目的。 Real-Time PCR原理 A. 螢光化學原理 B. 螢光強度計算原理 C. 數據分析 Real-Time PCR應用 A. 絕對定量Absolute Quantification B. 相對定量Relative Quantification C. 基因型鑑定SNP genotyping assay D. 微小 RNA偵測及定量 Real-Time PCR 螢光化學原理 雙股 DNA嵌合螢光染劑  SYBR Green dye SYBR Green dye a highly specific, double-stranded DNA binding dye, to detect PCR product as it accumulates during PCR cycles. 優點：不需額外合成特殊引子，方法簡單成本低，可 作melting curve分析。 缺點：若 PCR過程中有或有primer dimer或有非專一 性PCR產物均會影響判讀。 Real-Time PCR 螢光化學原理 特定序列螢光探針 TagMan® probe dual labeled probe –hydrolysis probe Molecular beacons FRET-Dual labeled probe- hybridization probe TagMan® probe dual labeled probe – hydrolysis probe 5’-end fluorophore:. FAM , TET 3’-end quencher: TAMRA, MGB • In Gene expression assays • Pharmacogenomics • Human Leukocyte Antigen (HLA) genotyping • Determine the viral load in clinical specimens (HIV, tuberc