散射／荧光比率法测定核酸.pdfVIP

维普资讯 第32卷第 3期 江西师范大学学报(自然科学版) Vo1．32No．3 2008年 6月 JOURNALOFJIANGXINORMALUNIVERSITY(NATURALSCIENCE) Jun．20o8 文章编号：1000-5862(2008)03—0281—05 散射 ／荧光 比率法测定核酸 刘雪莲， 潘 瑾 (重庆交通大学 河海学院，重庆 400074) 摘要 ：在pH9．62的BR缓冲溶液中，阳离子染料吖啶橙(A0)与鱼精DNA(~DNA)通过静电作用形成二元 复合物，导致AO在激发波长272Bin处产生增强的散射光，而在发射波长534Bin处出现荧光猝灭．利用共 存的散射和荧光信号，提出了一种散射／荧光比率法．在激发波长为272Bin和发射波长为534nln的条件 下，其散射／荧光比值 (I／F)和0．02～1．40tc／mL范围内的fsDNA溶液成一定的线性关系，据此测定核酸 的含量，其检出限为5．7~g／mL．此方法成功用于核酸合成样的测定 ，RSD为 1．3％～2．0％．实验结果表 明，比率法比单波长的散射法或荧光法灵敏度更高，线性范围更宽 ． 关键词 ：散射／荧光比率法；吖啶橙；核酸；鱼精DNA 中图分类号：Q523 文献标识码 ：A 目前，核酸(DNA)的测定方法有很多种，以分光光度法_】J和荧光光度法_2J使用较多．DNA本身在室温下 有较弱的内源荧光，但荧光量子产率低，不能直接加以测量，文献报道可用一些荧光小分子物质作为生物探 N 针，与DNA作用后导致荧光强度的增强或减弱来进行测定．常用的探针物质主要有荧光染料_3J、金属离／＼ 子4【J、金属配合物 5【J及纳米粒子6¨J等．近年来兴起的共振光散射法，由于其操作简便并且灵敏度较高，也逐 渐应用于核酸的分析测定中[7-11~．然而，使用荧光法或散射法测定通常限于单波长测定，会受到仪器响应、探 针浓度和所处环境的影响，这一弊端能够为双波长荧光或双波长散射比率法所解决llJ ．这些促使我们想 到了同时利用散射和荧光信号用于分析测定中，我们提出了一种以激发波长的散射增强和发射波长的荧光 猝灭的散射 ／荧光比率法，并成功地应用于核酸的分析测定． 吖啶橙 (AcridineOrange，简称 AO)，学名 3，6一(二甲胺基)吖啶盐酸盐 ，是一种三环杂芳香类染料，具有氮 杂葱结构的生物染色剂、指示剂 ，同时也是一种稳定的光敏剂．其结构式如下： N H A0是一种碱性阳离子染料，而核酸因带有大量的磷酸根而带负电荷．本文证明了在 pH为9．62的Brit． ton—Robinson(BR)缓冲液中，AO与核酸通过静电作用形成复合物，导致在激发波长为272nlTI处的散射信号增 强，在发射波长为534Bin处的荧光猝灭，其散射和荧光的比值与核酸的浓度呈一定的线性关系． 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 F-2500型荧光分光光度计 (日本 日立公司)，QL-901旋涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司)， pHS一3C酸度计(上海大中分析仪器厂)． 收稿 日期：2008—03．02 作者简介：刘雪莲(1981一)，女，重庆市忠县人，初级实验师，主要从事环境生化分析研究 维普资讯 江西师范大学学报 (自然科学极) 2008年 核酸溶液：将鱼精子DNA(fsDNA，上海生物化学研究所)在0～4cC的条件下溶于二次蒸馏水中，在4cC 的冰箱中放置 24h以上，并经常轻轻摇动所盛放的容量瓶．其准确浓度 由260