实验 八 质粒 DNA的提取及电泳分析.pptVIP

实验 六. 质粒 DNA的提取、　　　与电泳鉴定 l.1 质粒DNA的提取 原理： 　　　质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1一2OOkb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体申，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也可对宿主细胞的相应缺陷进行补偿。 本实验分离纯化的质粒pBR322、pUClg就是由CoJEI衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。 操作步骤： 　1.培养细菌 将带有质粒pUC l9或pBR 322的大肠杆菌接种在LB琼脂培养基上或液体培养基，37oC培养12-18h。 LB(Luria-Bertani)培养基成分如下:每升含有蛋白胨(Bacto-tryptone)lOg，酵母提取物( Bacto-yeast extract )5g，NaCl lOg，琼脂糖或琼脂(固体培养基时用)15g，用NaOH调pH至7.5。 2.从菌落中快速提取制备质粒DNA 1)、取液体培养菌液1.5 mL置Eppendorf 小管中，转速100OO r/min，离心20 Sec，去掉上清液。加入150 ?L GET缓冲液。充分混匀，在室温下放置lO min。溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用时新配制溶液。使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易与细胞壁接触。 2)、加入200 ?L新配制的0.2mol/L NaOH (内含1% SDS)。加盖，颠倒2-3次，使之混匀。冰上放置5 min。SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。 3)、加入15O?L冰冷的乙酸钾溶液(pH4.8)。加盖后颠倒数次使混匀，冰上放置l5 min。 4)、用台式高速离心机，转速为130O0 r/min，离心5min，上清液转移入另一干净的离心管中，乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，在冰上放置l5min是为了使沉淀完全。如果上清液经离心后仍混浊，应混匀后再冷却至O℃并重新离心。 5)、 向上清液中加入等体积酚/氯仿(l:l，V/V)，振荡混匀，转速130O0 r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。用酚与氯仿的混合液除去蛋白，效果较单独使用酚或氯仿更好。 6)、向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀放置2 min;离心20 min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 7)、加0.5 mL 70% 乙醇，盖好后上下轻轻倒置数次（洗去多余的盐分）并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥，待用(可以在 -20oC保存)。 1.2 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定 原 理 在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 电泳后的位置次序是：超螺旋、线性、　　　　　　　　　　开环。 电泳结果不能作为判断分子量大小的依据。 操作步骤： 　1、琼脂糖凝胶的制备 0.8%琼脂糖 in 1X TBE buffer ，倒胶前加入EB。 2、制板：凝胶的厚度在大约 0.6－0.7 厘米，不少于0.5 厘米 4、加样：每孔加样约15ul （25ul 样品＋5ul 样品缓冲液）。 样品缓冲液含有：a. 缓冲系统， b. 蔗糖， c.染料指示剂。 5、电泳：70V，0.5－1小时 6、观察、分析 TBE缓冲液配方： 10 X 贮液： 54 g Tris 碱 27.5 g 硼酸 20 ml 0.5 M EDTA, pH8.0 加水至500 ml. 标准分子量图谱 样板胶图 * *