T SPOT TB技术用于结核的辅助诊断.pdfVIP

维普资讯 生物与感染20O6年9月第 1卷第 3 · 新 技 术 与 新 仪 器 · TSPOTTB技术用于结核的辅助诊断 孟成艳 张 舒 金嘉琳 张文宏 近年来，我国结核病的发病率有上升趋势，临床 酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每 1个斑点代表 上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核 1个 IFN．分泌细胞 (结核特异的效应 T细胞)。根 病，而 目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺 据斑点数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的 乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与 效应T细胞 ，而对结核杆菌感染进行辅助诊断。 治疗 带来困难。酶联免疫 斑点法 (enzyme．1inked TSPO TTB操作方法 immunospotassay，ELISPOT)技术是一种新型的免疫 酶技术，从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细 采集8Hll患者的血液加人含枸橼酸钠的CPT 胞因子细胞 1。由ELISPOT发展而来的TSPOTTB 采血管内，分离PBMC，加入细胞培养液 ，轻轻重悬 (结核感染T细胞斑点试验)技术用于检测结核感染 细胞。在已包被抗 IFN．7抗体微量板的4个孔中， 后特异性T细胞分泌的7干扰素 (IFN．7)，并据此结 分别加人细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素 果判断是否感染结核。 (PHA)作为阳性对照，结核杆菌特异混合多肽A和 B分别含 EsAT．6与 CFP．10(OxfordlmmunoteLtd．， TSPOTTB技术原理 Oxford，UK)。然后在每个孔中加人含 250000个细 该方法源于 Mahairas等在 1996年发现的一段 胞的上述悬液。把微量板放在 37~C培养 16～20h 存在结核分枝杆菌(简称结核杆菌)中名为 “RD1”的 后，用PBS洗板4次 ，加人碱性磷酸酶标记的小鼠抗 基因序列_2J，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分 人 IFN．7单克隆抗体 ，在2～8~C下孵育 1h。孵育后 枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生 2 再用 PBS液洗板 4次。最后每孔加入显色底物液 种蛋 白：ESAT．6和 CFP．10(culturefiltrateprotein)， BCIP／NBTPLUS，室温中静置 7min后观察结果，并用 ESAT．6和CFP．10作为特异性抗原刺激机体特异性 计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计 T细胞产生 IFN．7。 (ELISPOT试剂盒由上海复星科技有限公司提供)。 根据这一原理，TSPOTI~技术是利用结核杆菌 第 1孔为阴性对照孔 ，第2孔为阳性对照孔。如出 感染者外周血单核细胞 (PBMC)中存在结核特异性 现斑点，说明试验成功。第 3、4孔为实验孔，当测试 T细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺 孔 A或B达到以下标准则判定为阳性结果：①如果 激后分泌 IFN．7而设计的 T细胞免疫斑点试验 。 阴性对照孔斑点数为0～5个，测试孔斑点数减去阴 PBMC、结核特异的混合抗原 A和混合抗原 B(分别 性对照孔斑点数 ≥6；②如果阴性对照孔斑点数≥6 为ESAT．6和CFP．10的部分多肽片段)，与对照试剂 个 ，测试孔斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。 一 起加人预先包被抗抗体的微孔培养板进行培养。 当PBMC中存在特异性 T细胞时，培养液中加入的 TSPO T