第章荧光免疫技术.pptVIP

2、抗体效价：双向免疫扩散试验 3、抗体特异性： 吸收试验（荧光抗体+过量抗原，检测阳性标本，无荧光） 抑制试验（阳性标本+未标记抗体，再加荧光抗体，无荧光） 基本原理：以镧系元素螯合物标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰。同时，激发光与荧光的波长差别（270nm）显著，可有效排除激发光的干扰，所得信号代表特异性荧光。 基本原理 荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。 ㈡酶和荧光底物 荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 标记酶 底物 荧光产物 激发光(nm) 荧光(nm) 相应信号 碱性磷酸酶 4-MUP 4-MU 360 450 10 β-半乳糖苷酶 4-MUG 4-MU 360 450 10 辣根过氧化物酶 HPA 二聚体 317 414 0.03 HPA：对羟基苯丙酸 方法类型 双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 荧光酶免疫测定 * 临床免疫学与免疫学检验 * 双抗体夹心法 固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物，酶催化生成荧光物质，发光量与待检抗原含量成正比。 荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）示意图 双抗原夹心法 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，加入底物，酶催化生成荧光物质，发光量与待检抗体含量成正比。 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。 方法评价 用酶和荧光底物的化学反应 作为放大系统，提高灵敏度 背景荧光干扰测定，用固相 荧光酶免疫测定效果好 荧光酶免疫测定 第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 ①自身抗体检测 抗核抗体(均质型) 抗核抗体(核膜型) 抗核抗体(斑点型) 一、荧光抗体技术的应用 ②病原体检测 寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫） 细菌（藤黄微球菌 ) 荧光抗体技术的应用 ③免疫病理检测 肿瘤（人肝癌细胞） 荧光抗体技术的应用 * 临床免疫学与免疫学检验 * ④细胞表面抗原和受体检测 将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各种数据。 ⑤特殊应用：流式细胞分析 荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。 荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用 时间分辨荧光免疫测定： 蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等 荧光偏振免疫测定： 药物、维生素、激素、常规生化项目等 荧光酶免疫测定： 病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等 * 临床免疫学与免疫学检验 * 大纲要求 掌握： 荧光、荧光效率、荧光猝灭、荧光抗体技术、荧光免疫测定（分析）、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定、荧光酶免疫测定等的概念，荧光抗体技术实验类型的原理及优缺点，时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定、荧光酶免疫测定的原理及方法类型。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 熟悉： 荧光抗体的制备，标本的制作，荧光免疫技术在医学检验中的应用。 了解： 荧光显微镜。 * 临床免疫学与免疫学检验 * 1．荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？ 2．常用的荧光物质有哪些？ 3．荧光免疫技术有哪些类型？ 4．荧光抗体技术的基本原理是什么？ 3．什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？ 4．荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？ 5．荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型? 思考题 * 临床免疫学与免疫学检验 * 6．时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 7．荧光偏振免疫测定的原理是什么？ 8．荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 9．如何评价各种类型的荧光免疫测定？ 10．荧光免疫测定有何应用？ 思考题 * 临床免疫学与免疫学检验 * 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。 荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应, 在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行