粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因的克隆与鉴定.pdfVIP

维普资讯 2006年33(4) 微 生 物 学 通 报 · 9l · 粗糙脉孢霉酸性蛋 白酶基因的克隆与鉴定 邱重晏 2 王正祥h (工业生物技术教育部重点实验室和江南大学生物工程学院 无锡 214036) (重庆工学院生物工程学院 重庆 400050) 摘要：以粗糙脉胞霉CICIM1~0021染色体DNA为模板，通过PCR扩增得到粗糙脉胞霉酸 性蛋白酶结构基因。对其序列进行了测定和分析，表明扩增得到的片段为酸性蛋 白酶基 因。将扩增出的酸性蛋白酶基因克隆入酵母表达载体中获得重组质粒pPIC9K-ap。将其转 化入毕赤氏酵母获得重组菌NA，。重组酸性蛋白酶在pH4．0和45。C下表现出最高活性。 关键词：粗糙脉胞霉，酸性蛋白酶，克隆，序列分析，表达 中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：0253-2654 (2006l04-0091-04 CloningandIdentificationofaGeileEncoding蛐 AcidicProtease from Nem．0spom crassa ‘ QIUChong．Yah · WANGZheng-Xiang。 (KeyLaboratoryD，IndustrialBiotechnology，MinistryofEducationandSchoolof Biotechnology，Southern Yaag~ Unl,x,rsity，Wu．xi214036)。 ( ofBiotechnology，ChongqingInstituteof 由蝴 ，Chongq~ 400o50) Abstract：A geneencodingapu~ veacidicproteasewa$isolatedfrom Neuro~, racnzm chromosomalDNA．The nucleicacidsequencingandanalysisindicatedtheamplifiedfragmentWaSanacidicproteasegene(叩)．Purified PCRpIoductW$8subclonedintoayeastexpressionvector，yieldingreco~ inantpPIC9K-ap．Therecombinant NA3wasconsturctedbytran~ormingpPIO Km intoP／ch／aPd KIW／1．Therecombinantacidicproteasepro- ducedby只 paaorb peao~ dthelIi activityatpH 4．0and45。C． Keywords：Neurosporac 啪 ，Acidicprotease，Cloning，Sequello~analysis，Expr~sion 酸性蛋白酶是适合在酸性条件下 (pH1．9～4．0)分解蛋白质的一类蛋白水解酶， 在其活性位点有两个天冬氨酸。其代表性特征是将两个疏水氨基酸打断，通过内切和 外切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸 ¨]，是食品、饲料、酿造、毛皮与皮革、胶原 纤维等工业重要用酶 。在酒精发酵中应用酸性蛋白酶，有利于原料中蛋白质的水解， 增加醪液中酵母可吸收性氨，促进酵母繁殖，提高酒精发酵速率，提高原料出酒率[3]。 在国外，毛霉属，根霉属，曲霉属，酵母属都有相关酸性蛋白酶基因被克隆及测序的报 道 。sIIimuta等利用转基因技术将Scytalidiumlignicolum中的酸性蛋白酶基因导人到 酵母中，获得分泌该种酸性蛋白酶的酵母突变体酿酒酵母 AH22，所产酸性蛋白酶最适 pH为2．3，在pH2．0～5．0之间稳定 J。 对粗糙脉孢霉 (Neurosporacrassa)OR74A基因组序列进行分析，发现有一