第七章 电镜冷冻制样技术NEWB.pptVIP

第七章电镜冷冻制样技术 ⑴基本过程：真空蒸发→真空镀膜 ⑵基本原理： ?有金属沉积的部位散射能力强，TEM像呈现暗区 ?无金属沉积的部位散射能力弱，TEM像呈现亮区 ⑶基本特点： ?图像反差明显，富有强烈的立体感 ?样品被“包埋”在金属膜中，即样品表面被金属粒 子覆盖，其图像分辨率由金属粒子大小限制，样 品表面细微机构看不清，只能看到表面形貌。 ?不能分辨杂质和病毒，造成鉴定上的困难，故对 病毒样品的纯度要求较高 真空镀膜仪：10－4～10－5Torr ⑴ 仪器结构 真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极（碳电 极、金属电极）；样品台。 真空系统：两级泵真空系统，10－4～10－5 Torr 加热电流供给系统：大电流变压器，提高40－ 50A电流。 ⑵ 真空的作用： 防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。 防止样品受到金属氧化而引起的污染。 ⑴.具有高电子密度，和较高的电子 散射能力 ⑵.在喷镀层中金属颗粒细小，分布均匀， 高温下不升华，经久耐用 ⑶.在电子束作用下，金属不会粒状化 ⑷.化学稳定，不与样品反应 ⑸.熔点低，易于蒸发 1、一次投影 A、样品的准备： 制备样品悬液→滴样品液→摆载网→ 放入真空镀膜仪 B、金属的选取： 蒸发材料有粒状、块状、细丝状、薄片状 高分辨率的样品：粒度较细的Pt，Pt-C， Pt-Pd合金 一般的样品：粒度粗、易蒸发，低价的 Cu，Al，Cr C 、投影角度θ的调整 调整原则：样品越细小，θ↘， 如核酸5～9 ° ，细菌30 ° 病毒、噬菌体12－15° 注意：样品与蒸发源的直线距离10cm D、金属投影 ?先喷3s~4min,厚10~20nm ?再 90 °垂直喷碳，加固 E、样品颗粒大小的测量 h:颗粒高度 θ:投影角度 l:照片上投影长度 M:放大倍数 H:蒸发源的高度 L:蒸发源与样品的水平距离 2、二次投影 一次投影之后，将样品旋转180°， 再次投影 3、旋转投影: 金属蒸发时,样品30～60转/min 适于：极小颗粒 金属投影的电镜图像样品的颗粒呈 黑色，投影区呈白色 唯一一种能用TEM观察样品表面方法 1、适用范围: 金属材料,矿物质、化合物表面 坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、 孢子、花粉、木材 2、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料表面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就是样品表面结构的一个“模子”，称之为复型（Replication)。 1、一级复型 （负复型） 基本描述：先用有机材料直接在样品表面 印制复型，再将复型膜剥离样 品，金属投影来增加反差。 常用介质：0.5～1%火棉胶醋酸戊酯溶液 或0.5%formvar氯仿溶液 基本步骤：滴加福尔莫瓦溶液→成膜→漂膜 →洗膜→捞膜→金属投影和喷碳 加固→观察 基本特点：分辨率高，20～50?，人工假象少； 复型膜软，剥离时易变形，且不易 与样品分离 基本描述：用较厚的有机材料在样品表面印制一 级复型，剥离后以此为模板，进行金 属投影和喷碳，制成二级碳复型，最 后溶去一级有机复型膜，留下二级碳 复型膜。 常用方法：AC纸-C二级复型法 基本步骤：贴AC纸→样表结构铸印于AC纸→ 揭下AC纸（一级复型）→ 用石蜡将AC纸粘于玻板→ 金属投影与喷碳（二级复型）→ 溶掉AC纸→水浴脱蜡→清洗→捞膜 4、拟复型法和微粒复型法 (一)、冰冻制样技术的分类 冷冻干燥、冷冻取代、冰冻超薄切片 冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等 (二)、特点： 1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态 2、避免了化学药剂对样品产生的影响，减 少了样品超微结构和成分的损伤，有利 于保护生物大分子活性，用于组织化