耐热赖氨酸氨肽酶菌株筛选、鉴定及基因克隆.pdfVIP

W U Yantao，etal：StrainwithThermo-Stable LysineAminopeptidase Isolation，IdentificationandGeneCloning 氨肽酶 (aminopeptidase，简称 AP)是可 以从多 1．1．4 主要试剂 DNA提取试剂盒 、胶 回收试剂 肽链 的N端顺序水解氨基酸 、使氨基酸逐个游离 出 盒 ：上海生物工程有限公司：所有底物 ：美国Alfa公 来的酶_ll。氨肽酶广泛分布于植物 、动物和微生物 中 司 ；限制性 内切酶 ：宝生物工程 (大连)有限公司 ；分 [21 其可用于肉制品加_I二，乳品业等 ；可减少制品苦 。 子级 的酵母粉 、蛋 白胨 ：英国Oxoid公司；其他试剂 ： 味，增加游离氨基酸，提高食品营养价值 ：还可用作 国产分析纯。 蛋 白序列测定的分子工具及重组蛋 白或融合产物 1．2 氨肽酶产生菌的筛选 的固化剂等。大多数食 品中蛋白原料经内切型商品 1．2．1 富集 将 10g土样加入 90mL／250mL的无 蛋 白酶类水解后 ，往往因为肽末端的疏水氨基酸存 菌生理盐水中，玻璃珠振荡均匀。取 0．1mL悬浮液 在 比例较高 ，常常会 出现苦味 。脱苦 问题是蛋 白酶 加入 50mL／250mL富集培养基 中，37℃、200r／min 解产物在食品中扩展应用的主要障碍。赖氨酸氨肽 富集培养24h。 酶 (Lysineaminopeptidase，KAP)不仅偏好从 N一末端 1．2．2 初锦 将经富集培养的菌液用无菌水适当 水解多肽链释放 出赖氨酸 ，有利于提高必需氨基酸 稀释 ，取一定量涂布到脱脂牛奶琼脂平板中，37℃ 的含量 ．且对一些疏水性氨基酸末端水解能力相对 培养 24h，将产生透明圈的菌株点种到另一个脱脂 较强 ．因此该类酶在食品加工和饲料添加剂方面有 牛奶琼脂平板上 ，培养 48h，测得 透明 菌落≥2．5 广泛的应用价值l31。 的菌株作为待研究的出发菌株。 耐热氨肽酶具有提高化学反应速率 、简化工 1．2．3 复筛 复筛利用 LNA法 I，测定初筛所得菌 艺、降低成本 、提高产品质量 、活性稳定和耐贮藏等 株发酵液 中氨肽酶的活性 。首先加入 2mLpH8．5 优点 ，因此具有更广 阔的应用前景 。国内外关于耐 Tris—HC1缓冲液和 1mL底物 (L一亮氨酸对硝基苯 热氨肽酶的研究鲜见报道。已经发现产耐热氨肽酶 胺 L—leu—pNA)，然后再加入稀释一定倍数 的发酵 的 菌 株 有 ：Bacillusstearothermophilus ．Bacillus 液，在 50℃水浴反应 10min后 ，0D 比色测定酶 kaustophilus5[1．Thermusaquaticusl61．Aquifexaeolicus 活。 I ． COCCll5horikoshii[81和 Pseudoill~nq5aeruKtnosa 1．2．4 酶活定义 在 50℃，每分钟分解L—leu～pNA 191 产生 ltxmoL的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活 ， 但是大多数研究内容仍主要集 中在酶的分离纯 化及酶学表征方面 ，尚较少有耐热氨肽酶的异源表 单位。 达等方面的研究 1．3 氨肽酶产生菌的鉴定 作者筛选得到一株产耐热赖氨酸氨肽酶 的菌 1．3．1 形态及理化鉴定 参阅 《伯杰 氏细菌鉴定手 株 ，对该菌进行 了鉴定 。对其在 E．