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实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定.doc
实验植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
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Ⅰ 考马斯亮蓝 G – 250 染色法
一、原理
考马斯亮蓝 G – 250 ( Coomassie brilliant blue , G-250 )法是利用蛋白质 – 染料结合的原理,定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式,最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ,通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约 2 min 即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定 1 h ,之后,蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比 Lowry 法灵敏 4 倍),易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备
(一)实验材料
植物材料。
(二)试剂
1. 标准蛋白质溶液( 100 μg / mL 牛血清白蛋白):称取牛血清蛋白 25 mg ,加水溶解并定容至 100 mL ,吸取上述溶液 40 mL ,用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。
2. 考马斯亮蓝试剂:称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ,溶于 50 mL 90 %乙醇中,加入 100 mL 85 %( W / V )的磷酸,再用蒸馏水定容到 1000 mL ,贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。
(三)仪器设备
分光光度计,离心机,研钵,烧杯,量瓶,移液管,试管等。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制
取 6 支试管,按表 26–1 加入试剂,摇匀,向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂,摇匀,并放置 5 min 左右,以 0 号试管为空白对照,在 595 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样品测定
( 1 ) 样品提取 称取鲜样 0.25 ~ 0.5 g ,用 5 mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后, 3000 r/min 离心 10 min ,上清液备用。
( 2 )吸取样品提取液 1.0 mL (视蛋白质含量适当稀释),放入试管中(每个样品重复 2 次),加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置 2 min 后在 595 nm 下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量。
表 26-1 绘制标准曲线的各试剂加入量
试 剂 管 号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白质( mL ) 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水量( mL ) 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 蛋白质含量( μg ) 0 20 40 60 80 100 ?
四、结果计算
( mg/g )
?
式中: C ——查标准曲线值, μg 。
V T ——提取液总体积 , mL 。
W F ——样品鲜重 , g 。
V S ——测定时加样量 , mL 。
?
Ⅱ Lowry 法(劳里法)
一、原理
Lowry 法是双缩脲法( Biuret )和斐林( Folin )–酚法的结合与发展,其原理是:蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后,碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应,形成铜–蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后,在碱性条件下,这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定,很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关,所以可以用于蛋白质含量的测定。 Lowry 法除使肽链中络氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈,其显色效果比单独使用酚试剂强 3 ~ 15 倍,约是双缩脲法的 100 倍。由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。 Lowry 法适于微量蛋白的测定,对多个样品同时测定较为方便。但对于不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的 SDS )。
1. 双缩脲法的原理 双缩脲( NH 2 – CO – NH – CO – NH 2 )在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩脲反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键,因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得,操
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