第二章 生物大分子的制备.ppt

2.3.2 透析 Thomas Graham 1861年发明透析方法 透析是生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。 生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。 2.3.4 冰冻干燥 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。 冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。 Analytical technology of biochemistry * 生化分析技术 农学院生物技术教研室 Analytical technology of biochemistry 生物大分子主要是指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。 在植物中广泛存在的生物碱、萜类、皂苷、纤维素、果胶等成分有一些特殊的性质，本章把它们也做为研究范畴。 第二章 生物大分子制备 2.1 概述 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。 分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活是生物大分子提取制备最困难之处。 过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的。 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。 生物大分子制备 有以下主要特点 需要了解的生物大分子的物理、化学性质 生物大分子的制备通常可按以下步骤 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。 ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ④生物材料的破碎和预处理。 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： ①在水和各种有机溶剂中的溶解性。 ②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。 ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 ⑥对其他生物分子的特殊亲和力等。 注意植物的季节性、地理位置和生长环境。 选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。 选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。 2.2 生物大分子的前处理 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料。 2.1.1生物材料的选择 材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 2.2.2 细胞的破碎 除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生