HaloTag 技术在α-突触核蛋白质的细胞影像与定量分析中的应用.pdfVIP

2014年 6月 首 都 医 科 大 学 学 报 Jun. 2014 第35卷 第3期 Journal of Capital Medical University Vol.35 No.3 [doi:10.3969/j.issn.1006-7795.2014.03.013] ·基础研究 · HaloTag技术在 α-突触核蛋白质的细胞影像与 定量分析中的应用 1 2 2 2 2 1* 2 冯雪婷 张晨光 张 敏 岳志霞 邢天禹 李慎涛 丁 卫 (1. 首都医科大学基础医学院免疫学系,北京 100069;2. 首都医科大学基础医学院医学遗传学系,北京 100069) 【摘要】 目的 探讨HaloTag技术用于α-突触核蛋白质(α-synuclein,SNCA)在细胞内荧光成像及半定量分析的方法及其应用。 方法 采用重组克隆技术构建pHalo-SNCA质粒,将其转染至HEK293人胚肾细胞中,经Western blotting鉴定Halo-SNCA融合蛋 白质的表达;通过激光共聚焦显微镜观察Halo-SNCA在细胞内的定位与分布;通过蛋白酶催化的解偶联反应的荧光强度测定细 胞内Halo-SNCA 的荧光强度进行目的蛋白质的间接定量分析。 结果 本研究成功构建了Halo-SNCA真核表达质粒,能够在转染 的真核细胞中高效表达目的融合蛋白质,该融合蛋白质结合特定的荧光配基后,可通过激光共聚焦显微成像分析Halo-SNCA在 细胞中的动态水平与分布状况。 此外,经水解释放的荧光配基可用于表达融合蛋白质在细胞中较为精确的相对定量分析。 结论 HaloTag技术能够用于SNCA在细胞内成像和定量分析,同时可以作为细胞生物学和生物化学分析的可关联检测指标。 对于 SNCA 的生理功能以及在神经系统病变中的作用等相关研究,HaloTag具有令人瞩目的潜在应用前景。 【关键词】 HaloTag;α-突触核蛋白质;荧光成像;定量分析 【中图分类号】 R392.1 Application of HaloTag technology in the intracellular imaging and quantitative analysis of alpha-synuclein 1 2 2 2 2 1* 2 Feng Xueting ,Zhang Chenguang ,Zhang Min ,Yue Zhixia ,Xing Tianyu ,Li Shentao ,Ding Wei (1. DepartmentofImmunology,Schoolof BasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2. Departmentof Medical Genetics,School of Basic Medical Sciences,Capital Medical University,Beijing 100069,China) 【Abstract】 Objective To develop a novel method for intracellular imaging and semi-quantification of alpha-synuclein(SNCA) using HaloTag technology by staining of fluorescent fusion proteins. Methods The mammalian expression vector of a Halo-SNCA was constructed,and the obtained plasmid was transfected into HEK293 cells. The expressed fusion protei