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．62． ；专题报告 丙型肝炎病毒的细胞培养 00083 寇毅 李彤 庄辉 北京大学医学部基础医学院微生物学系 1 C 丙型肝炎病毒 hepatitis 纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。目前主要采用干扰素和利巴韦林联合治疗丙型肝炎，但并非对所有慢性丙型肝 炎患者均有效。 病毒颗粒的感染性很低，且蛋白表达水平极不稳定。由于缺乏有效的HCV体外细胞培养体系，严重影响了HCV 复制的分子机制及新抗HCV药物的研发。 勒大学丙型肝炎研究中心在7月22日“科学”杂志上发表题为“丙型肝炎病毒在细胞培养中完全复制”r论文【61。 崭新的阶段。本文对该3种HCV体外细胞培养体系的建立、验证和特点综述如下。 一、HCV克隆和细胞系 2 JFH-1／GND株：是在JFHl株的基础上，将其NS5B 蛋白到NS2的编码区的亚基因组复制子 sUbgenomic 输血后非甲非乙型肝炎患者体内获得的la型HCV毒株。 6 FL-J6／JFH full 区构建了2种HCV全长基因组嵌合体。 cellline 培养HCV最常用的细胞系是Huh7 humanhepatoma cellline humanhepatocadnoma2，HepG2 、HeLa等。 二、HCV细胞培养体系 Wakita掣4谰体外转录获得JFHl Huh7细胞，证明在Huh7细胞系中JFHl具有较高的复制率： 1 用Northernblot检测不同时间收获的细胞 h即可检测到全长HCVRNA，72h时仍 培养物中的总RNA，发现经JFHl转染的细胞培养物，从转染后24 为阳性； 2 用Western h至72 从转染后24 h均为阳性； 3 免疫荧光法也显示，在转染JFHl后72h培养物中，仍能检测到70％～ 均为阴性。此外，Wakita等将不同方法构建的HCV 第五届全国肝脏疾病临床暨中华肝脏病杂志成立十周年学术会议 ·63． l timedetectionreverse RNA水平。在JFH real transcfiptionPCR，．RTD-PCR 定量检测培养物中HCV 转染的细胞系中，培养上清液中病毒RNA的水平在转染后5d内迅速增长，随后7d仍能维持在高水平 约为 107拷贝／rrd ，然后缓慢下降，但到30 到相似的结果。但JFHl／AEl-E2和SGR-JFHl转染的细胞培养上清液中，HCVRNA水平则快速降低。说 明在JFHl转染的细胞中HCV可持久复制。 抗性HCVRNA具有相同的沉降密度1．17 毒制备物，观察到金标记的内部核区高电子密度的球状结构，内环是核衣壳：直径30～35nm，略有棱角。整 个HCV颗粒的直径是50～65nm，与预期大小相符； 3 用转染JFHI或JFHl／AEl-E2的细胞培养上清液 接种天然Huh7细胞，培养48 颗粒的感染性。 感染性较差。 有体外感染活性的HCV病毒颗粒，沉降密度约为1．105g／ml，与丙型肝炎患者血清中产生的病毒颗粒密度较 Huh7．5细胞系含有I／5A-GFP-6 等用人IFN—Y连续3周处理Huh7．5细胞系，消除了I／5A-GFP-6HCV复制子，获得了Huh7．5．1细胞系。 他们用JFHlRNA转染Huh7．5．1后发现： 1 转染8d后，HCV 胞总RNA ，尔后，胞内HCV 并维持高水平直至实验结束 26 d，仅 2％的转染细胞为NS5A免疫荧光染色阳性，到第24天时达到100％阳性，提示HCV转染的细胞获得选择性生 清液中，具有体外感染活性，经2次在天然Huh7．5．1细胞中传代，其感染活性未丧失，均于培养7d时达到最 高水平，此时抗NS5A多克隆抗体免疫荧光染色显示，几乎所有培养的细胞均为NS5A阳性，提示所产生的病 异性抗体和CD8l抗体中和。 Huh7．5．1细胞系转染体系具有以下特点： 1 病毒在转染后24h内能完全进入细胞； 2 转染后病毒可扩 focus 散到未被转染的细胞，传染性病毒的滴度从检测不到上升至104～105ffu／ml fluorescentunit／m1 ，N doublingtime 均约22 h，较Tanaka等[1l】报道的在患者和感染的黑猩猩中HCV的倍增时间6～8h为长； 4 对JFHl病毒的嗜细胞性研究发现，该克隆也可在Huh7细胞中复制，并产生相似量的感染性病毒颗粒，但与 Huh7．5．1细胞系比较，病毒复制动力学延迟。JFH 该细胞培养体系的不足是：所产生的HCV颗粒的感染性未经黑猩猩感染实验验证；高复制率可能增加病毒 的突变率。 HCV， 细胞系。该3种HCV嵌合基因组或亚基因组在转染Huh7．5后，均具有HCV RNA复制能力，在转染48h后 ．64． 专题报告 IIIII