丙烯腈%2f丙烯酸共聚物电纺膜表面酶固定化的研究.pdfVIP

丙烯腈/丙烯酸共聚物电纺膜表面酶固定化研究 余安国，黄小军，蒋珺，潘超，钱锦文，徐志康* 浙江大学高分子系，高分子合成与功能构造教育部重点实验室，杭州310027 酶的固定化，即用载体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并 能有效提高酶的稳定性和重复使用性的一类技术。自上世纪50 年代以来，固定化酶在食品、医 药、化工、环保、生物工程等诸多领域均显示出了十分重要的应用前景。固定化酶膜能将酶的高 效催化性能和膜的优良分离性能有机结合起来，从而构成酶膜反应器。但是，酶在固定化过程中 常会出现如下两个问题： 1 过低的载酶量和较大的反应扩散阻力显著影响固定化酶的催化效 率； 2 酶与膜材料间的非生物特异性相互作用会导致固定化酶的失活。与传统的酶固定化载体 材料相比，纳米纤维具有极大的比表面积、极高的孔隙率和极好的孔连通性。用它作为酶固定化 载体材料，可有效提高载酶量，并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散，固定化 [1-3] 酶的催化效率能得到显著提高 。 本文通过水相沉淀聚合合成了丙烯腈/丙烯酸共聚物，采用静电纺丝法制备共聚物纳米纤维 电纺膜，通过碳二亚胺法将具有优异生物相容性的蛋膜素和胶原蛋白固定于丙烯腈/丙烯酸共聚 物电纺膜表面，从而为酶蛋白构建仿生修饰层；随后，用戊二醛法将脂肪酶固定于修饰后的电纺 膜表面 如图 1 。我们系统研究了蛋膜素和胶原蛋白修饰对固定化脂肪酶的活性、载酶量和反应 动力学参数的影响。 * CH2 CH CH2 CH * n m CN COOH GA EDC/NHS PANCAA Nanofibrous membrane GA ES hydrolysate Collagen Lipase Figure 1. Schematic representative for the preparation of the support and enzyme immobilization. 为了证实纳米纤维电纺膜表面化学改性反应的发生，采用异硫氰酸荧光黄 FITC 对改性前后 纳米纤维电纺膜进行了荧光标记，并借助激光共聚焦扫描显微镜 LCSM 进行表征和比较。结果 如图2 所示。可以发现，与未改性纳米纤维电纺膜相比，经蛋膜素和胶原蛋白修饰的纳米纤维电 纺膜具有较强的荧光强度，表明蛋膜素和胶原蛋白成功地固定到纳米纤维电纺膜的表面。 1 2 3 Figure 2. a Images of the nanofibrous membrane: 1 original PANCAA nanofibrous membrane; 2 ES hydrolysate modified nanofibrous membrane; 3 collagen modified nanofibrous membrane. 自由酶和固定化脂肪酶的活性、载酶量以及反应动力学参数列于表1。结果表明，未修饰膜、 蛋膜素修饰膜和胶原蛋白修饰膜上的固定化酶活性保留率分别为15.0%、20.4%和61.7% 。可见， 纳米纤维表面蛋白质的引入使得固定化酶的活性得到显著提高。另外，未修饰膜、蛋膜素修饰膜 和胶原蛋白修饰膜上的固定化酶最大催化反应速率分别3.61 U/mg，5.40 U/mg 和16.5 U/mg，蛋 白质修饰使得电纺膜表面固定化酶的催化最大反应速率V ，均明显大于未修饰电纺膜，其中胶 max 原蛋白修饰的效果尤为明显。进一步说明，纳米纤维表面蛋白质的引入提高了膜表面的生物相容 性，为固定化酶提供一种生物友好微环境，促进了固定化酶活性的提高。 Table 1 Activity and kinetic parameters V , K for the free and immobilized lipases under optimum max m conditions Bound Specific Activity Vmax Sample protein activity Km mM retention % U/mg mg/g U/mg Free lipase - 23.0 100 25.2 0.48 Lipase immobilized on nascent 11.69 3.44 15.0 3.61 0.95 PANCAA nanofibrous membrane Lipase immobilized on ES hydrolysate-modified PANCAA 9.47 4.70 20.4 5.40 1.01 nanofibrous membrane Lipase immobilized