生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究课件.pptVIP

第一部分 生物起搏器种子细胞筛选 第二部分 HCN通道电生理及药理学实验研究 胺碘酮对HCN通道激活曲线的作用 胺碘酮的使用依赖性阻滞作用 结 论 胺碘酮可呈浓度依赖性及使用依赖性阻滞HCN通道 且并不改变其电流激活的电压依赖性 其对HCN通道可能是一种开放态阻滞作用 谢谢 表面标记物检测（P5） 抗原表达水平无显著差异 增殖能力比较 * P 0.05 ** P 0.01 ASCs体外扩增能力强于BMSCs 且P15仍保持较高的增殖能力 ASCs和BMSCs向心肌细胞分化 能力比较 （P5） (×400) 犬ASCs心肌样分化能力强于BMSCs a ASCs b BMSCs c 两者对比 RT-PCR检测加入5-AZa后ASCs与BMSCs HCN4 mRNA的表达 a ASCs b BMSCs c 两者对比 各个时间点ASCs中HCN4 mRNA表达量均高于BMSCs ASCs和BMSCs转染HCN4效率比较 （×400） a ASCs b BMSCs c 两者对比 P5代ASCs与BMSCs转染效率无显著统计学差异 P 0.05 （×400） ASCs和BMSCs转染HCN4后凋亡率比较 a ASCs b BMSCs c 两者对比 P5代ASCs转染HCN基因后凋亡率低于BMSCs P 0.05 结 论 来自同一个体的ASCs与BMSCs相比 具有更强的体外增殖能力 具有更强的向心肌样细胞及窦房结样细胞分化的能力 二者基因转染效率相似，但转染HCN4基因后 ASCs 凋亡水平更低 主要内容 HCN通道在卵母细胞中的表达 HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs 胺碘酮对HCN通道的作用及机制 HCN通道在卵母细胞中的表达 爪蟾卵母细胞 HCN通道基因 分离 扩增、酶切、线性化 培养 体外转录 细胞内显微注射 通道表达 卵母细胞钳记录通道电流 实验流程 电生理学指标 电流表达幅值 通道动力学特性 HCN通道电流 A.HCN1 电流 B.HCN2 电流 C.HCN4 电流 D.激活曲线 HCN通道动力学 A.典型电流 B.I-V曲线 C.去激活常数 D.激活常数 HCN1/HCN2共表达形成的电流幅值 HCN1/HCN4共表达形成的电流幅值 HCN2/HCN4共表达形成的电流幅值 HCN1/HCN2与单个亚型通道动力学比较 A.电流图 B.激活时间常数 C.激活曲线 HCN1/HCN4与单个亚型通道动力学比较 A.电流图 B.激活时间常数 C.激活曲线 HCN2/HCN4与单个亚型通道动力学比较 A.电流图 B.激活时间常数 C.激活曲线 结 论 HCN1、2和4共表达后均可形成复合体电流 HCN2/4以1:1比例共表达所形成的复合体电流幅度最大，激活速度最快 HCN2/HCN4通道复合体转染ASCs 实验流程 共聚焦照相 ASCs细胞培养 构建荧光标记基因 质粒转染细胞 固定 提取RNA RT-PCR检测 抽提蛋白 Western blot 爬片 通道电流记录 共转染HCN2/4通道 通道mRNA表达水平 通道蛋白表达水平 封接带荧光的ASCs细胞 ×200 膜片钳记录HCN电流 通道动力学研究 激活常数 激活曲线 结 论 HCN2及HCN4通道可分布在ASCs细胞膜的共同区域 两者共表达存在促进作用 HCN2/HCN4通道复合体表达在ASCs上与表达在爪蟾卵母细胞上的电生理学特性一致 较单一亚型具有更快的激活动力学特性 胺碘酮对HCN通道的作用及机制 胺碘酮对HCN通道浓度依赖性阻滞 生物起搏种子细胞筛选及HCN通道电药理学实验研究 报告人：杨靖 导 师：黄从新 教授 研究背景 缓慢性心律失常为临床常见多发病 电子起搏器植入术是治疗严重缓慢性心律失常的首选方案 电子起搏器存在缺陷 非生理性起搏 电池寿命有限 易受外界电磁干扰等 生物起搏器构建--当前研究热点 主要内容 生物起搏器种子细胞筛选 HCN通道电生理及药理学实验研究 研究对象 心脏干细胞（CSCs） 脂肪干细胞（ASCs） 骨髓间充质干细胞（ BMSCs） CSCs的相关研究 研究内容 CSCs的分离培养及其鉴定 5-氮杂胞苷诱导CSCs向窦房结样细胞分化 实验方法 小园形、亮的细胞从组织移植块中爬出（箭头所示）（×200） 流式细胞仪分选 左图，分选前流式细胞仪检测培养细胞c-kit阳性率 右图，用流式细胞仪分选经 c-kit 标记的细胞 流式细胞仪检测 流式细胞仪鉴定分选后CD34、CD45的阳性率 倒置显微镜观察 分选后的单个细胞（左图），培养后簇集式增殖、心球样细胞团形成（右图）（×200） 荧光显微镜观察 在光学显微镜下(左图)、荧光显微