柠檬酸摇瓶发酵及提取byLeMon.ppt

柠檬酸摇瓶发酵及提取 生技08-2班 L3eMon小组 廖维华 刘露 刘豫宁 麻佳佳 实验目的： 1、学习掌握柠檬酸液体发酵工艺 2、了解柠檬酸提取工艺 3、增强团队协作能力 柠檬酸：C6H8O7 物化性质：白色结晶粉末，无臭。 ? 熔点(℃), 153 ℃。味极酸，在潮湿的空气中微有潮解性。它可以以无水合物或者一水合物的形式存在：柠檬酸从热水中结晶时，生成无水合物；在冷水中结晶则生成一水合物。加热到78 ℃ 时一水合物会分解得到无水合物。加热至175 °C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。所以，柠檬酸提取过程中，温度控制很重要。 分子式： 实验原理 高度亲水性 实验原理 柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。 但就柠檬酸产生菌（黑曲霉菌）而言，在实验pH下，其顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸。 柠檬酸的发酵的过程 80%的糖代谢走EMP途径 黑曲霉中存在TCA的酶系 柠檬酸发酵的条件 1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖； 2、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为主；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低； 3、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速200r/min）。 生产菌种： 黑曲霉 Aspergillus niger 半知菌亚门，丝胞纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属。真菌中的一个常见种。生长适温37℃，最低相对湿度为88% 柠檬酸产量最高的菌种。且能利用多样化的碳源。 生产方法： 深层液体发酵法 发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化 实验流程 斜面 发酵培养基 接种 补糖 4d ,28℃ 提取 （马铃薯葡萄糖琼脂培养基） （摇床） （每48h补一次） 2C6H8O7·H2O + 3CaCO3 → Ca3(C6H5O7)2·4H2O + 3CO2↑ + H2O 中和终点pH:6.0～6.8温度：50～70℃ 菌液过滤 中和 酸解 过滤 脱色 去金属离子 浓缩结晶 Ca3(C6H5O7)2·4H2O + 3H2SO4 + 4H2O → 2C6H8O7·H2O + 3CaSO4·2H2O ，85℃ 在此温度下各种变体石膏的溶解度均最小），并有利于形成片状 的半水石膏，便于过滤 加热至80～90℃加热的作用： 终止发酵；使蛋白变性凝固，降低发酵液黏度；使菌体中的柠檬酸释放 活性炭，1～3%，85℃，搅拌30min 强酸型阳离子交换树脂 50～60℃，常压浓缩易分解成乌头酸，且结晶色泽变深 提 取 工 艺 流 程 1、菌种：黑曲霉 Aspergillus niger 2、培养基： PDA(马铃薯葡萄糖琼脂 )培养基,发酵培养基(土豆 200g 煮汁、 蔗糖20g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；pH=5 ) 3、器材：三角瓶2个，棉塞2个，纱布若干，接种环，小烧杯，水浴加热锅，离心机，离心管，PH试纸，电子天平，滤纸，大试管, 电炉（加石棉网）, 摇床, 玻璃棒，无菌tip头，移液枪，碱式滴定管，电子显微镜 4、试剂：无菌水，酚酞，0.1429～0.1430 mol/L NaOH溶液，CaCO3， 10% H2SO4， 40%蔗糖溶液 实验器材 实验步骤 2、发酵培养基配制及分装 （以实验室为单位） 配方： 土豆 200g 煮汁、 蔗糖20g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；pH5 （总糖100 g/L；基础 20 g/L +补糖 80 g/L ） 分装： 每小组2瓶，每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa，20min 3、制备孢子悬液及接种 （以小组为单位） 向每支斜面菌种加入5ml无菌水，用接种环刮菌苔表面或用无菌tip头轻轻吹打制备孢子悬液；将悬液接入灭菌并冷却至室温的培养基。 注： 勿接入过多孢子，否则菌丝过于浓密，影响产酸和后处理中的过滤 4、摇瓶发酵、补料及参数检测 摇瓶条件： 200rpm，32℃；发酵4天 补料： 发酵48h补糖，每瓶（100ml）加入灭菌40%蔗糖液27ml。 参数检测： 接种后每24h取样测定、记录发酵液pH。 5、发酵液酸度测定 酸度 — 是指100ml发酵液所